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Metagenômica de um consórcio microbiano termofílico na detecção de genes de enzimas celuloliticas e expressão heteróloga em Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3)

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dc.contributor Queiroz, Marisa Vieira de
dc.contributor Silveira, Wendel Batista da
dc.contributor.advisor Passos, Flávia Maria Lopes
dc.creator Colombo, Lívia Tavares
dc.date.accessioned 2017-04-07T16:46:59Z
dc.date.available 2017-04-07T16:46:59Z
dc.date.issued 2015-03-13
dc.identifier.citation COLOMBO, Lívia Tavares de. Metagenômica de um consórcio microbiano termofílico na detecção de genes de enzimas celuloliticas e expressão heteróloga em Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). 2015. 102 f. Tese (Doutorado em Microbiologia Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2015. pt-BR
dc.identifier.uri http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/10022
dc.description.abstract Neste trabalho foi construída uma biblioteca metagenômica a partir de um consórcio microbiano termofílico com aproximadamente 135.000 clones, abrigando cerca de 3,5 Gpb de DNA metagenômico. Essa biblioteca foi construída com o objetivo de identificar genes que codificam enzimas lignocelulolíticas para serem expressos na levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). De 6.720 clones analisados (5 % do total), foram obtidos 182 hits positivos para atividades de celulases, xilanases e β-glicosidases, com seleção e sequenciamento de 30 fosmídeos que deram origem à identificação de 34 ORFs codificando para enzimas glicosil hidrolases, relacionadas com a hidrólise de celulose e hemicelulose. Paralelo à construção da biblioteca, foi obtido uma linhagem de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3) mutante (ura3 ̄ ). Pela primeira vez nesta levedura a deleção deste gene foi realizada utilizando-se a técnica split-marker, com seleção dos mutantes primeiramente em placas contendo geneticina e, posteriormente, associados à seleção em placas contendo ácido 5-fluorótico (5-FOA). Os resultados apresentados mostram que esta técnica de deleção pode ser eficientemente empregada para K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), mesmo levando-se em conta a diploidia desta linhagem. A partir da obtenção do mutante ura3 ̄ , deu-se a construção do vetor pKmLPG para ser usado como sistema de expressão para essa levedura, uma vez que a marca de seleção contida neste vetor é o gene URA3. A característica diferencial e promissora deste sistema de expressão é o uso da sequência do promotor do gene que codifica a enzima endo-polygalacturonase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). A confirmação do vetor pKmLPG será realizada por sequenciamento. Sem essa confirmação, utilizou-se então o vetor de expressão pKMCL para clonagem de três genes de β-glicosidase isolados a partir da biblioteca fosmidial na levedura K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). O vetor pKMCL é derivado do vetor de expressão pKLAC2 de K. lactis e utiliza a marca de seleção que confere resistência ao antibiótico geneticina. Por realização de teste enzimático dos transformantes em meio sólido, observou-se a presença de atividade extracelular de β-glicosidase endógena de K. marxianus CCT 7735 (UFV- 3). Com o genoma desta levedura anotado, foi possível identificar o gene, e juntamente com os demais genes de β-glicosidase (P3Gli, P8Gli e P9Gli), foram preditas as estruturas tri-dimensionais dessas proteínas. A confirmação dos transformantes para os genes P3Gli, P8Gli e P9Gli foi realizada por PCR, e atividade de β-glicosidase foi detectada tanto no sobrenadante extracelular quanto na região do periplasma em oito das nove cepas transformantes analisadas. Os resultados de expressão heteróloga de β-glicosidades em K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) mostram que esta linhagem pode ser usada como hospedeira na expressão de diferentes genes lignocelulolíticos, com expectativa de uso das linhagens recombinantes capazes de secretar celulases visando a produção de etanol celulósico. pt-BR
dc.description.abstract A metagenomic library harboring around 3,5 Gpb was constructed from a thermophilic microbial consortium. The aim of this library was to identify genes coding lignocellulolytic enzymes that could be expressed in the yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3). In total, 6,720 clones (5% of all clones) were analysed and 182 positive hits were found for cellulases, xylanases and β-glucosidases. The sequencing of 30 selected fosmids resulted in the identification of 34 putative open reading frames (ORFs) coding glycoside hydrolases involved with cellulose and hemicellulose degradation. Simultaneously, a defective mutant strain of K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) for gene ura3 was obtained. The gene was deleted by using, for the first time in this yeast, the split- marker technique that consisted in a first selection of mutants in solid medium with the antibiotic geneticin followed by a second selection in the presence of 5- Fluoroorotic Acid. The results presented here demonstrated the efficiency of the split-marker technique in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3), even though this is a diploid strain. Once the ura3 - was obtained, the vector pKmLPG was constructed using the URA3 as a marker gene in order to have an expression system for the ura3 - mutant strain. The differential and promising feature of this vector lies in the presence of the promoter sequence of the gene coding an endo-polygalacturonase enzyme from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3). The confirmation of the correct vector construction will be performed by sequencing. In order to express genes isolated from the metagenomic library in the yeast K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) three genes coding β-glucosidase were cloned onto the vector pKMCL. This vector is derived from pKLAC2 of Kluyveromyces lactis and it uses the resistance gene for the antibiotic geneticin as a marker. Extracellular activity of endogenous β- glucosidase from K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) was detected by enzymatic assay in solid medium during the analyses of transformants, and based in the annotated genome of this yeast, was possible to identify the β-glucosidase gene. The three dimensional structure of the endogenous protein as well from those codified by the β-glucosidase genes (P3Gli, P8Gli and P9Gli) were predicted. The confirmation of transformants for the cloned genes P3Gli, P8Gli and P9Gli was done by PCR, and the β-glucosidase activity was detected in both extracelllular supernatant and periplasm region in eight of nine transformants analysed. Results of heterologous expression of β-glucosidase in K. marxianus CCT 7735 (UFV-3) demonstrated that this strain can be used as a host for expression of various lignocellulolytic genes, with the expectation to use recombinant yeast strains capable to secret celulases targeting the production of cellulosic etanol. en
dc.description.sponsorship Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pt-BR
dc.language.iso por pt-BR
dc.publisher Universidade Federal de Viçosa pt-BR
dc.rights Acesso Aberto pt-BR
dc.subject Genética molecular pt-BR
dc.subject Genômica pt-BR
dc.subject Enzimas celulolíticas pt-BR
dc.subject Kluyveromyces marxianus pt-BR
dc.title Metagenômica de um consórcio microbiano termofílico na detecção de genes de enzimas celuloliticas e expressão heteróloga em Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3) pt-BR
dc.title Thermophilic microbial consortium metagenomic for detection of genes coding cellulolytic enzymes and heterologous expression in Kluyveromyces marxianus CCT 7735 (UFV-3) en
dc.type Tese pt-BR
dc.subject.cnpq Ciências Agrárias pt-BR
dc.creator.lattes http://lattes.cnpq.br/4745874654946687 pt-BR
dc.degree.grantor Universidade Federal de Viçosa pt-BR
dc.degree.department Departamento de MIcrobiologia pt-BR
dc.degree.program Doutor em Microbiologia Agrícola pt-BR
dc.degree.local Viçosa - MG pt-BR
dc.degree.date 2015-03-13
dc.degree.level Doutorado pt-BR


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  • Microbiologia Agrícola [287]
    Teses e dissertações defendidas no Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola

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