Clonagem e expressão in vitro da ORF AC5 do Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) e produção de anti-soro

Abstract

O Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) é um begomovírus descrito como parte de um complexo viral causando mosaico dourado e deformação (rugosidade) foliar em tomateiro na região do Triângulo Mineiro, Minas Gerais. Os dois componentes genômicos encontram-se completamente sequenciados, e a análise das seqüências de nucleotídeos do DNA-A indicou a presença de uma ORF adicional denominada AC5, presente apenas em algumas espécies de begomovírus. Esta ORF está quase totalmente inserida na sequência do gene cp, porém em orientação inversa e em outra fase de leitura. A ORF AC5 do ToRMV tem o potencial de codificar uma proteína com aproximadamente 27 kDa. A função do produto potencial da ORF AC5 foi estudada apenas para o Watermelon chlorotic stunt virus (WmCSV), não sendo encontrado nenhum indício da expressão da ORF. Entretanto, a seqüência de aminoácidos da proteína potencialmente codificada pela ORF AC5 do ToRMV possui apenas 41% de identidade com a AC5 do WmCSV. É possível que a ORF AC5 do ToRMV seja expressa, e que a proteína desempenhe alguma função no ciclo de infecção viral. Este trabalho teve por objetivo a clonagem e a expressão in vitro da ORF AC5 do ToRMV e a producão de anti-soro específico. Oligonucleotídeos específicos foram utilizados para a amplificação da região codificadora da ORF AC5 via PCR. O fragmento amplificado foi clonado no vetor de expressão pRSET-C. Plasmídeos recombinantes foram utilizados para a expressão da proteína AC5 em E. coli BL21::DE3. A proteína foi purificada a partir das células de E. coli e utilizada para a produção de anti-soro policlonal em coelhos. A especificidade do anti-soro policlonal obtido foi confirmada por Western blot. Esse anti-soro poderá ser utilizado em ensaios de imunolocalização da proteína AC5 em tecidos infectados pelo ToRMV.

Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) is a typical bipartite begomovirus described as part of a viral complex inducing golden mosaic and leaf distortion (rugosity) in tomatoes at Triângulo Mineiro, Minas Gerais. Both genomic components have been completely sequenced, and the DNA-A sequence analysis indicated the presence of an additional open ready frame (ORF), named AC5, present in only a number of begomovirus species. This ORF is almost fully inserted into the cp gene, but in opposite orientation and in a different reading frame. The AC5 ORF of ToRMV has the potential to encode for a 27 kDa protein. The function of a putative AC5 protein has only been studied for Watermelon chlorotic stunt virus (WmCSV), but no evidence of its expression was found. However, the amino acid sequence of the putative AC5 protein from ToRMV is only 41% identical to the WmCSV AC5. It is thus conceivable that the ToRMV AC5 is expressed and plays a role in the viral infection cycle. The objective of this work was to clone and express the ToRMV AC5 ORF in vitro, and to raise an AC5-specific antiserum. Specific primers were used to direct the PCR-based amplification of the ToRMV AC5 ORF. The amplified fragment was cloned into the expression vector pRSET-C. Recombinant plasmids were used for protein expression in E. coli BL21::DE3. The AC5 protein was purified from E. coli cells by affinity chromatography and used for the immunization of rabbits. The specificity of the polyclonal antiserum obtained was assayed by Western blot. This antiserum can now be used in immunolocalization studies attempting to detect the AC5 protein in ToRMV-infected tissues.