Berinjela transgênica cv. Embú avaliada mediante a resistência a insetos, a nematóides e aos efeitos genotóxicos pelo teste de mutação e recombinação somáticas (SMART) em asas de Drosophila melanogaster

Abstract

Avaliaram-se a resistência de berinjela ‘Embú’ controle e transgênica, contendo a região codante do gene orizacistatina, às espécies Meloidogyne incognita, M. javanica e M. arenaria. Foi verificado que a berinjela transgênica foi altamente suscetível a M. incognita, M. arenaria e M. javanica, assim como a berinjela controle as espécies M. incognita e M. javanica com grande número de galhas e número de ovos. Portanto, a transgênese não afetou a resposta de berinjela ‘Embú’ aos nematóides avaliados. A resistência às espécies de pulgões (Myzus persicae e Macrosiphum euphorbiae) e lagartas (Mechanitis polymnia e Mechanitis lysimnia) também foi avaliada. Trabalhou-se com uma geração de M. persicae e de M. euphorbiae para elaboração de tabelas de vida. Foram detectados efeitos significativos das linhagens da planta quanto às características (Ro - taxa líquida de reprodução, rm - razão infinitesimal de aumento populacional e λ - razão finita de aumento populacional) estudadas, exceto para tempo de geração (T). O efeito da espécie de pulgão foi significativo para todas as características, enquanto que o efeito da interação entre linhagem da planta e espécie de pulgão não foi significativo para nenhuma das características. Conclui-se que o ciclo biológico de M. persicae e M. euphorbiae foi alterado, sendo que Ro, rm e λ foram menores nas plantas transgênicas. Para o teste de resistência à lagartas, foram avaliados a área foliar consumida, o número de indivíduos e sua mortalidade, nas fases de desenvolvimento (da lagarta até a fase adulta). Não foram observadas significâncias para as características (duração do período pupal, e mortalidade larval e pupal) avaliadas, à exceção da duração larval. Em relação à área foliar consumida pelas lagartas, observou-se que não houve diferença entre as linhagens da planta e na interação entre linhagem e espécie da lagarta, porém houve diferença em todos os parâmetros avaliados (área foliar total e diária consumida em centímetros quadrado e em porcentagem) quando analisada as espécies de lagarta. Assim, as plantas transgênicas utilizadas não apresentam atividade sobre a mortalidade e duração das fases larval e pupal de Mechanitis polymnia e M. lysimnia. Atividade genotóxica de extratos de berinjela transgênicos utilizados como alimento na dieta de larvas de Drosophila melanogaster, na forma de extratos de frutos in natura e aquecidos em banho-maria a 45oC foi avaliada pelo SMART (somatic mutation and recombination test). Em berinjela ‘Embú’, foram incorporados os genes das construções pRGG hpt, pOZC6 e pCLDO04541, chamados de HPT-1, OZC-2 e SW5-3, respectivamente. Foram realizados dois experimentos independentes nos quais foram testados os mesmos frutos de cada linhagem in natura. No experimento II foram acrescentados os mesmos frutos aquecidos e mais dois frutos: OZC-4 e SW5-5. Além desses, diluiu-se o triturado do fruto OZC-2 a uma concentração de 25%. Em cada experimento também foram incluídos um controle positivo (Ciclofosfamida) e um negativo (água). Em ambos experimentos, resultados positivos foram observados para o controle positivo e em algum dos tratamentos com berinjela transgênica in natura e aquecidos. Por comparação das progênies obtidas no SMART, observou que ocorreu recombinação em alta frequência. Frações de todos os frutos liofilizados das plantas transgênicas e controle, utilizados no SMART, foram mantidos a –80oC e foram, posteriormente, utilizados para detecção de Agrobacterium tumefaciens. Após a rehidratação dos tecidos, com água destilada e estéril, esses foram plaqueados, sob condições assépticas, e avaliado o crescimento de bactérias e sua natureza pelo teste ketolactose. Dos seis frutos utilizados (Berinjela controle, HPT-1; OZC-2, SW5-3, OZC-4, SW5-5) foram isoladas 10 colônias de bactérias, apenas dos fruto SW5-3 e SW5-5. Dessas, 5 colônias foram identificadas pelo teste Ketolactose como Agrobacterium tumefaciens. À luz dos resultados, conclui-se que apesar das evidências de que extrato de berinjela induziu a recombinação somática em D. melanogaster, a ausência de dados na literatura acerca da aplicação deste teste na caracterização de efeitos genótoxicos, advindos dos produtos dos transgenes, sugere que outros estudos devem ser conduzidos, para determinar o(s) agente(s) indutor(es) de recombinação, inclusive aqueles advindos de bactérias residentes nos tecidos de frutos transformados e de possíveis situações de estresses de natureza biótica ou abiótica.

Control and transgenic eggplants for the orizacystatin gene were evaluated as for resistance to nematode species Meloidogyne incognita, M. javanica, and M. arenaria. Transgenic eggplants were highly susceptible to M. incognita, M. arenaria, and M. javanica, as well as the control eggplants were to M. incognita and M. javanica, with high number of galls and eggs produced in the roots. Therefore, the transgenesis did not affect the response of ‘Embú’ eggplant to the nematodes evaluated. The resistance to species of aphids (Myzus persicae and Macrosiphum euphorbiae) and butterfly larvae (Mechanitis polymnia and Mechanitis lysimnia) was also evaluated. For elaboration of life tables, a generation of Myzus persicae and Macrosiphum euphorbiae was used. Significant effects of plant lines were detected for the parameters studied (Ro - net reproductive rate, rm - intrinsic rate of population increase e λ - finite rate of population increase), except for generation time (T). The effect of aphid species was significant for all parameters evaluated, whereas the effect of interaction between plant line and aphid species was not significant for the parameters analyzed. It can be concluded that the biological cycle of M. persicae and M. euphorbiae was alterated, since Ro, rm and λ were smaller in the transgenic plants. For the resistance test to butterfly larvae, consumed leaf area, individual number and mortality were evaluated during the different stages of its development (from larval to adult stage). Significant differences for the parameters evaluated (time period of pupal stage and larval and pupal mortality) were not observed, with exception of time period of larval stage. In relation to consumed leaf area by the larvae, it was observed no difference between the plant lines and no interaction between the plant lines and larvae species; however, differences in all parameters evaluated (total and daily leaf area consumed) were observed depending on larvae species. Thus, the transgenic plants analized did not have any influence on the mortality and time period of larval and pupal stages of Mechanitis polymnia and M. lysimnia. The genotoxic activity of fruit extracts (in natura and preheated at 45 o C) from transgenic eggplants, used as food in the diet of Drosophila melanogaster larvae, was evaluated by the somatic mutation and recombination test (SMART). The T-DNAs from the constructs pRGG hpt [containing the genes hygromycin phosphotransferase (hpt) and β -glucuronidase (uidA), pOZC6 [containing the genes orizacystatin (ozc), uidA, and neomycin phosphotransferase II (nptII), and pCLDO04541 [containing the genes npt and Sw5], were incorporated into eggplant cv. Embú, called of HPT-1, OZC-2 and SW5-3, respectively. Two independent experiments were performed, in which the same fruits from each line were tested in natura. In the experiment II, it was added the same preheated fruits and additional two fruits: OZC-4 and SW5-5. Besides, the triturated from the fruit OZC-2 was diluted to a concentration of 25%. It was also included, in each experiment, a positive (Cyclophosphamide) and a negative (water) control. In both experiments, positive results were observed for the positive control and also in some treatments with transgenic eggplant in natura and preheated. Comparing the progenies obtained in the SMART, it was verifyed the occurrence of recombination at high frequency. Fractions of all lyophilized fruits from transgenic and control plants, used in the SMART, were kept at –80oC, and then utilized for the detection of Agrobacterium tumefaciens. After re-hydration of the tissues, with sterile destilled water, they were plaqued, under asseptic conditions, and the bacterial growth and nature were evaluated by the ketolactose test. Among six fruits analized (control, HPT-1, OZC-2, SW5-3, OZC-4, and SW5-5), bacterial colonies (total of 10) were isolated only from SW5-3 and SW5-5 fruits. Five colonies were identifyed by the ketolactose test as Agrobacterium tumefaciens. Despite evidences that extracts from transgenic eggplant induced somatic recombination in D. melanogaster, it can be concluded that the absence of data in the literature, concerning the application of SMART in the characterization of genotoxic effects of transgenic products, suggests that other studies need to be accomplished, aiming to determine the inductive agent(s) of recombination, including those from bacteria resident in transformed fruit tissues and from possible situations of stress of biotic and abiotic nature.