Viruses of phytopathogens: adaptation and modulation of pathogenesis in Ralstonia spp. and Alternaria alternata

Abstract

Viruses of phytophatogens are present in the most diverse groups of hosts, infecting from Spiroplasma to nematode and playing an important role in the ecology of these hosts. Because of the potential as biological control agents, the discoveries about these viruses have increased which encourages the ecological management of plant diseases. In this context, this study aimed: isolate and characterize viruses that infect plant pathogenic fungi (1) and Ralstonia spp. in the Americas (2) and investigate antiviral defense mechanisms in Ralstonia spp. (3). In this thesis, three viruses were characterized at biological and molecular level. Two viruses infect bacteria, Ralstonia spp. and the third infect a fungus, Alternaria alternata. The bacterial virus displayed two propagation modes: pseudolysogenic for the RsIBR1 inovirus (Inoviridae) and lytic for the phiAP1 phikmvvirus (Podoviridae). RsIBR1 has been shown to dramatically change the phenotype of the host, while not causing cell lysis, converting the phytopathogenic R. pseudosolanacearum into a commensal bacterium. PhiAP1 was characterized as a new member of the genus Phikmvvirus, and the presence of exolisinas, in addition to the bactericidal properties and EPS degradation make this virus attractive for future proposals of the bacterial wilt management. In A. alternata, it was characterized Alternaria alternata parititivirus 1 (AtPV1), a new divergent mycovirus related to genus Gammapartitivirus. Its persistent lifestyle prevented to dissect completely the interaction, because in the absence of isogenic lineage, it is unclear whether the viral infection led to a conversion of a pathogen in a epiphytic or still if is responsible for controlling phenotypic plasticity expressed by the host. The presence of canonical CRISPR loci in Ralstonia spp. isolates suggested that, in these hosts, this system could compose the antiviral defense arsenal. However, here was demonstrated that in R. solanacearum, the CRISPR-Cas system is unable to acquire new spacers or interfere with foreign DNA, even in a state of priming. The expression of the Cas genes was not detected; indicating that Cas operon apparently is a suppressed transcriptional unit. Two genes h-ns, expressed in R. solanacearum CFBP2957 are candidates to the putative transcriptional repression of CRISPR. The BIMs (Bacteriophages Insensitive Mutants) who escaped of infection by an alternative strategy to the CRISPR, were less competent, but still permissive to viral adsorption, and were able to survive under high inoculum pressure, which excludes the presence of abortive systems. Viral replication was also not detected and sequencing of two BIMs genome revealed the presence of particular mutations in genes encoding components of the secretory and motility pathways (such as Type II and Type IV), potentially involved in the antiviral resistance. Additional analyzes are being conducted to characterize in detail this defense strategy. In conclusion, the discovery and characterization of viruses infecting phytopathogens in Brazil expand the information on this diversity, little known in America, exposes the biotechnological potential of these natural enemies and reveals the important role of these viruses in the modulation and evolutionary course of their hosts

Vírus que infectam fitopatógenos são encontrados nos mais diversificados grupos de hospedeiros, infectando desde spiroplasmas a nematóides e desempenhando papel relevante na ecologia desses hospedeiros. Graças ao potencial como agentes de controle biológico, as descobertas sobre esses vírus tem aumentado o que amplia as perspectivas do manejo ecológico de doenças de plantas. Neste contexto, este trabalho objetivou: Isolar e caracterizar vírus que infectam fungos fitopatogênicos (1) e os que infectam Ralstonia spp. no continente americano (2) e Investigar mecanismos de defesa antiviral in Ralstonia spp (3). Nesse trabalho, três vírus foram caracterizados a nível biológico e molecular. Dois deles infectam bactérias do complexo Ralstonia spp. e o terceiro infecta um fungo, Alternaria alternata. Os virus de bacterias isolados possuem dois modos de propagação distintos: pseudolisogênico, o inovírus RsIBR1 (Inoviridae) e lítico, o phikmvvirus phiAP1 (Podoviridae). RsIBR1 demonstrou ser capaz de alterar drasticamente o fenótipo do hospedeiro, convertendo a bactéria fitopatogênica R. pseudosolanacearum em uma comensal. PhiAP1 foi caracterizado como um novo membro do gênero Phikmvvirus, e a presença de exolisinas em adição as propriedades bactericida e de degradação de EPS o tornam atrativo para futuras propostas de manejo da murcha-bacteriana. Em A. alternata, foi caracterizado o Alternaria alternata parititivirus 1 (AtPV1), um novo micovírus divergente, relacionado ao gênero Gammapartitivirus. Seu estilo de vida persistente impediu dissecar por completo a interação, pois na ausência da linhagem isogênica, não foi possível confirmar se a infecção viral conduziu a uma conversão de um patógeno em um epifítico ou ainda se é responsável pelo controle da plasticidade fenotípica manifestada pelo hospedeiro. A presença de loci CRISPR canônicos entre isolados de Ralstonia spp. sugeriu que nesses hospedeiros esse sistema pudesse compor o arsenal de defesa antiviral. No entanto, aqui foi demonstrado que em R. solanacearum, o sistema CRISPR é incapaz de adquirir novos spacers ou interferir com DNA invasor, mesmo em estado de priming. A expressão dos genes Cas não foi detectada, indicando que o operon Cas aparentemente é uma unidade transcricional reprimida. Dois genes h-ns, expressos em R. solanacearum CFBP2957 são candidatos na execução da provável repressão do CRISPR. Foram obtidos BIMs (Bacteriophages Insensitive Mutants) que escaparam da infecção por uma estratégia alternativa ao CRISPR. Os BIMs foram menos competentes, mas ainda permissivos a adsorção viral, e foram hábeis para sobreviver sob alta pressão de inóculo, o que exclui a presença de sistemas abortivos. A replicação viral também não foi detectada e o sequenciamento do genoma de dois BIMs revelou a presença de algumas mutações em genes que codificam proteínas componentes das maquinarias de secreção e motilidade bacteriana (Tipo II e Tipo IV), potencialmente envolvidas com o fenótipo da resistência. Análises adicionais estão sendo conduzidas para caracterizar em detalhes essa(s) estratégia(s) de defesa. Em conclusão, a descoberta e caracterização de vírus que infectam fitopatógenos no Brasil, além de ampliar as informações sobre essa diversidade, pouco conhecida na América, expõe o potencial biotecnológico desses inimigos naturais e revela o papel relevante desses vírus na modulação e curso evolutivo dos seus hospedeiros.