Isolamento e caracterização do gene que codifica nitrato redutase em Penicillium expansum

Abstract

O gene que codifica nitrato redutase em Penicillium expansum foi isolado de um banco genômico construído no vetor fago lambda EMBL3. Um fragmento de DNA de 3,17 Kb, contendo parte da região codificadora do gene da nitrato redutase de Penicillium chrysogenum, foi utilizado como sonda. Quatro fagos recombinantes foram isolados e denominados λPENR1, λPENR3, λPENR5 e λPENR6, com fragmentos de DNA clonados de 14,4; 14,4; 12,3 e 12,6 Kb, respectivamente. A análise por hibridização do DNA dos fagos recombinantes, clivado com Sal I, identificou fragmentos cujos tamanhos correspondiam a 4,7 Kb (λPENR1), 6,0 Kb (λPENR3), 8,4 Kb (λPENR5) e 7,6 Kb (λPENR6). Para a construção do mapa físico de restrição do fago recombinante λPENR3, foram feitas clivagens simples e duplas com enzimas de restrição. A análise de restrição e hibridização dos fragmentos de DNA do fago recombinante λPENR3 revelou que o gene nia estava presente em um fragmento de 6,5 Kb. Este fragmento foi subclonado no plasmídeo pBluescript SK+, e o plasmídeo recombinante foi denominado pPENR. Para a construção do mapa físico de restrição de pPENR, foram feitas clivagens simples e duplas com enzimas de restrição. O plasmídeo recombinante pPENR foi utilizado na transformação dos mutantes Nia^- de P. expansum e Penicillium griseoroseum, sendo obtida uma freqüência de 16 transformantes por μg de DNA.

The gene encoding nitrate reductase from Penicillium expansum was isolated from a lambda EMBL3 genomic DNA library. A 3.17 Kb DNA fragment containing part of the coding region for nitrate reductase from Penicillium chrysogenum was used as a probe. Four recombinant phages were isolated and the recombinant phages were labeled λPENR1, λPENR3, λPENR5 e λPENR6, containing cloned DNA fragments of 14.4; 14.4; 12.3 and 12.6 Kb, respectively. DNA hybridization analysis of the recombinant phages cleaved with Sal I identified DNA fragments whose sizes were 4.7 Kb (λPENR1), 6.0 Kb (λPENR3), 8.4 Kb (λPENR5) and 7.6 Kb (λPENR6). For the construction of the a physical restriction map of the recombinant phage λPENR3, single and double digestions with restriction enzimes were performed. Restriction and hybridization analysis of the recombinant phage λPENR3 DNA fragments showed that the nia gene was present in a 6.5 Kb DNA fragment. This fragment was subcloned in the plasmid pBluescript SK+ resulting in plasmid pPENR. For the construction of the a physical restriction map of pPENR, single and double digestions with restriction enzymes were carried out. The recombinant plasmid pPENR was used for transformation of nitrate non-utilising strains of P. expansum and Penicillium. griseoroseum, and a frequency of 16 transformants per μg of DNA was achieved.