Criopreservação de sêmen e avaliação histológica e funcional do testículo de periquitos australianos (Melopsittacus undulatus SHAW, 1805)

Abstract

O periquito australiano (Melopsittacus undulatus) de vida livre habita as regiões áridas e semi-áridas do interior da Austrália. Sua criação em cativeiro teve início na metade do século XIX devido sua grande adaptabilidade e reprodutibilidade. É considerado pela IUCN (2009) como Least Concern , ou seja, sem ameaça de extinção. Assim como para a maioria das aves silvestres, poucos são os estudos sobre a morfofisiologia reprodutiva de psitacídeos, levando à escassez de conhecimentos sobre a reprodução dessas aves. O desenvolvimento de protocolos de reprodução assistida em espécies modelos que não se encontram em vias de extinção é essencial para extrapolação metodológica na utilização de biotécnicas reprodutivas. Os animais do presente experimento foram alocados nas dependências do Hospital Veterinário da Universidade Federal de Viçosa. A coleta de sêmen foi realizada três vezes por semana via massagem digital na porção dorso caudal da cavidade celomática. O sêmen foi coletado das papilas dos ductos deferentes, na parede da cloaca, por meio de tubos de micro hematócrito graduados não heparinizados. O volume de sêmen coletado foi diluído em solução de Ringer com lactato, e os espermatozóides foram classificados quanto à motilidade e vigor, sendo também calculados a concentração espermática e o percentual de anormalidades. Posteriormente as amostras foram rediluídas nos meios Lake®, TRIS-citrato-gema de ovo e TES-TRIS para teste de resfriamento a 5ºC. Para o teste de congelamento, amostras foram fracionadas em 2 alíquotas contendo 6 e 11% de glicerol. Uma amostra de cada tratamento foi submetida a dois processos de congelamento: uma curva rápida de resfriamento/congelamento e uma curva ultrarrápida de resfriamento/congelamento. Após o descongelamento foram considerados os mesmos parâmetros de análise para o sêmen a fresco, além do teste de termorresistência e dos testes hiposmótico, supravital e coloração por fluorescência para verificar a integridade de membrana. O meio Lake® apresentou melhores resultados para o resfriamento do sêmen após 24 horas. Não foram observados resultados satisfatórios de motilidade, vigor e testes de integridade de membrana após o descongelamento das amostras nos diferentes protocolos. Foi ainda avaliado o processo espermatogênico de periquitos australianos. Quatro dias previamente à coleta dos testículos, em três animais foi aplicado 0,1 ml de bromodeoxiuridina via sistêmica. Os testículos foram coletados e processados segundo técnica rotineira para inclusão em resina e parafina. Cortes em resina foram corados com azul de toluidina e analisados com técnicas qualiquantitativas enquanto os cortes em parafina foram corados segundo técnica imunocitoquímica. Foram verificados índices indicativos de alta produção espermática, como índice gonadossomático (1,4%), proporção volumétrica dos túbulos seminíferos (97%), diâmetro médio do túbulo seminífero (314 μm), altura do epitélio seminífero (96,7 μm), 12,4 metros de túbulo seminíferos por grama de testículo, reserva espermática por grama de testículo (551,7 x 106), produção espermática diária (171,3 x 106) e produção espermática diária por grama de testículo (342,7 x 106). O arranjo celular ao longo do ciclo do epitélio seminífero foi semelhante àquele descrito em mamíferos, sendo possível a definição de 8 estádios do ciclo do epitélio seminífero. Semelhante as demais espécies de aves estudadas, cinco a nove áreas com estádios distintos foram observados em uma única secção transversal do túbulo seminífero conferindo a característica helicoidal da espermatogênese. A frequência relativa dos oito estádios do ciclo do epitélio seminífero de periquitos australianos foi: estádio 1 (9,35); estádio 2 (5,33); estádio 3 (26,09); estádio 4 (11,06); estádio 5 (22,28); estádio 6 (16,17); estádio 7 (5,89) e estádio 8 (3,84). Os estádios pré divisionais somaram 40,8%, o divisional 11% e os estádios pós divisionais somaram 48,2% seguindo a mesma tendência encontrada em codornas. A duração do ciclo do epitélio seminífero em periquitos australianos foi de 1,66 dias, menor que em todos os mamíferos e aves estudadas. Nas áreas correspondentes ao estádio I do ciclo do epitélio seminífero de periquito australiano, foram observados em média 55,42 espermatogônias, 53,01 espermatócitos jovens, 44,68 espermatócitos velhos, 176,56 espermátides arredondadas e 7,06 células de Sertoli. Foi observada uma perda de aproximadamente 16% de espermatócitos durante a prófase meiótica. A perda registrada de espermátides arredondadas durante as divisões meióticas não foi significativa sendo que das quatro células esperadas, cerca de 3,95 espermátides foram produzidas. Cada célula de Sertoli no epitélio seminífero do periquito australiano foi capaz de sustentar e manter 46,72 células da linhagem germinativa, das quais 25,02 eram espermátides arredondadas.

The budgerigar (Melopsittacus undulatus) in a wild life lives in dry regions and semi-dry in the middle of Australia. Its captive breeding has started in the middle of the XIX century caused by its great ability of adaptation and reproduction. Its considered by the IUCN (2009) as "Least Concern", which means no instinction menace. As well as the major of exotic birds, there is just a few studies of the reproductive morphophysiology of psittaciformes, which comes with the scarcity knowledge of these birds reproduction. The development of assisted reproduction protocols in model species which are not in extinction routes is essential to methodologically expand the use of biothecnics of reproduction. The animals of the present experiment were located inside the Veterinary Hospital of The Federal University of Viçosa. The sperm collection had been done three times a week by digital messages in the celomatic cavity of the backflow. The sperm was collected from the vas deferens of the papillae, the wall of the cloaca, by the graduated micro tubes hematocrit not heparinized. The sperm volume collected were diluted in a Ringer with lactate solution, and the sperm were classified by their motility and sperm vigor, the sperm concentration was calculated too and the percentage of anomalies. Later samples were rediluted inside Lake®, TRIS-citrate-egg yolk and TES-TRIS to the cooling test at 5°C. In the freezing test, the samples were fractionated in 2 rates with 6 and 11% of glycerol. A sample of every treatment was subjected to two freezing processes: one fast curve of cooling/freezing and a real fast curve of cooling/freezing. After thawed the same parameter analysis of the fresh sperm were considered, above the thermoresistence test and the hypoosmotic test, supravital and coloring by fluorescence to check the membrane integrity. The Lake® portion showed better results to the cooling sperm after 24 hours. It was not observed any satisfactory motility result, sperm vigor and membrane integrity tests after the thawed samples at the different protocols. It was also evaluated the spermatogenesis process of budgerigar. Four days before the collection of the testicles, it was introduced 0,1ml of bromodeoxyuridine in the systemic route. The testicles were collected and processed by the routine technique to include resin and paraffin. Resin cuts were colored with blue toluidine and analyzed with qualitative and quantitative technique while the paraffin cuts were colored by the immunocytochemistry technique. It was noticed many indicative rates of high esperm production, as gonadosomatic rate (1,4%) volumetric proportion in the seminiferous tubules (97%), medium diameter of the seminiferous tubules (314 μm), seminiferous epithelium height(96,7 μm), 12,4 meters of seminiferous tubules per gram of testicles, spermatic reservation per gram of testicles (551,7 x 106), spermatic daily production (171,3 x 106) and spermatic daily production per gram of testicle (342,7 x 106). The cell arrangement during the long cycle of the seminiferous epithelium was similar to the one described in mammals, being possible to define 8 stages of the seminiferous epithelium cycle. Similar to the other birds species already studied, five to nine areas with distincted stages were observed in only one cross section of the seminiferous tubule giving the spermatogenesis helical characteristic. The relative frequency of the eight stages of the seminiferous epithelium cycle in budgerigar was: stage 1 (9,35); stage 2 (5,33); stage 3 (26,09); stage 4 (11,06); stage 5 (22,28); stage 6 (16,17); stage 7 (5,89) e stage 8 (3,84). The predivisional stages totaled 40,8%, the divisional 11% and the posdivisional stages totaled 48,2% folowing the same tendency found in quails. The duration of the seminiferous epithelium cycle in budgerigar was about 1,66 days, less than all studied mammals and birds. In the corresponding area of the stage 1 of the budgerigar s seminiferous epithelium cycle, it was observed in average 55,42 spermatogonias, 53,01 young spermatocytes, 44,68 old spermatocytes, 176,56 rounded spermatid and 7,06 Sertoli cells. It was observed loss of approximately 16% of spermatocytes during the meiotic prophase. The registered loss of rounded spermatides during the meiotic division was not significant and that the four expected cells, around 3.95 spermatides were produced. Every Sertoli cell inside the budgerigar s seminiferous epithelium was able to support and to keep 46,72 germline cell, in which 25,02 were rounded spermatides.