Estado viável não cultivável em Salmonella enterica: indução, perfil de proteínas intracelulares e detecção de mRNA

Abstract

O patógeno de origem alimentar, Salmonella spp. entra no estado viável não cultivável (VNC) em resposta a condições ambientais adversas. A presença de células VNC é um problema de saúde pública porque células neste estado não são detectadas pelas metodologias tradicionais utilizadas de rotina em laboratórios, resultando em avaliação inadequada de alimentos contaminados com patógenos. Os objetivos deste trabalho foram avaliar a influência da estirpe, do meio de suspensão de células, da concentração salina e da densidade populacional inicial na entrada de Salmonella enterica no estado VNC e estudar o perfil de proteínas intracelulares e a presença de transcritos dos genes invA, rpf, katF e rDNA 16S na população de S. Enteritidis PT4 963 no estado VNC. A população de S. enterica que permaneceu no estado VNC variou significativamente entre as estirpes e condições utilizadas. A perda da culturabilidade foi mais lenta (p<0,001) em células mantidas a 4 °C em meio infusão de cérebro e coração (BHI) acrescido de NaCl do que as mantidas em solução fosfato de Butterfield (BPS). Células mantidas a 4 °C em BHI adicionado de NaCl apresentaram percentual de células viáveis menor (p<0,05) no momento em que a culturabilidade não era mais detectada. A maior perda de culturabilidade foi obtida em meios com 1,2 mol/L de NaCl (p<0,001). As linhagens S. Enteritidis PT4 963 e S. Typhimurium ATCC 14028 mantidas a 4 °C em solução BPS adicionada de NaCl 1,2 mol/L apresentaram os maiores índices de entrada em estado VNC (p<0,001). As menores taxas deperda de culturabilidade e também as maiores reduções nas contagens de microrganismos viáveis foram observadas em densidade populacional inicial de 107 UFC/mL (p<0,05) se comparadas às amostras inoculadas com 105 e 103 UFC/mL. O perfil de proteínas intracelulares de S. Enteritidis PT4 963 no estado VNC difere do encontrado em células nas fases exponencial e estacionária de crescimento e sob resposta a estresse osmótico, por baixa temperatura e falta de nutrientes. A não detecção de proteínas com massa molecular superior a 63 kDa e a presença de proteínas com massas moleculares menores nas células no estado VNC sugerem a ocorrência de proteólise para garantir o aporte de nutrientes e a manutenção de viabilidade. Nossos resultados indicam que o estado VNC constitui um estado fisiologicamente distinto no ciclo de vida de Salmonella enterica sorovar Enteritidis PT4. No entanto, não conseguimos detectar uma proteína específica das células de Salmonella no estado VNC. A quantidade de RNA total diminuiu aproximadamente 600 vezes em células no estado VNC quando comparada à quantidade obtida de células em crescimento ativo. Não foram detectados os transcritos correspondentes aos genes invA, rpf e katF em S. Enteritidis PT4 963 no estado VNC nas condições experimentais utilizadas. Entretanto, a expressão do 16S rRNA foi detectada em células VNC. Estes resultados sugerem que S. Enteritidis PT4 no estado VNC está ativa metabolicamente pela produção de transcritos para o rDNA16S e que este housekeeping gene pode ser considerado um bom marcador de viabilidade celular para Salmonella enterica sorovar Enteritidis PT4 no estado VNC.

The foodborne pathogen Salmonella spp. enters into a viable but nonculturable state (VBNC) in response to adverse environmental conditions. The presence of VBNC cells is a public health concern since it may be overlooked under standard routine laboratory procedure, resulting in improper assessment of contaminating pathogens in food. This work was done to investigate the influence of strain, cell suspension media, saline concentration, and initial population density on the induction of VBNC state in Salmonella enterica and to evaluate the intracellular protein profile and the presence of invA, rpf, katF, and 16S rDNA gene transcripts in VBNC Salmonella enterica serovar Enteritidis PT4 963. The entry into VBNC state in S. enterica varied significantly between strains and was also influenced by the saline concentration, suspension media, and initial population density. The culturability loss was lower (p<0.001) in cells maintained at 4 °C in Brain and Hearth Infusion broth (BHI) than in cells in Butterfield's Phosphate Solution (BPS). The cells maintained at 4 °C in BHI added with NaCl showed lower (p<0.05) viablility when culturability could no longer be detected. The highest rate of culturability loss was obtained in media x with 1.2 mol/L NaCl (p<0.001). The strains S. Enteritidis PT4 963 and S. Typhimurium ATCC 14028 maintained at 4 °C in BPS added with 1.2 mol/L NaCl showed the largest (p<0.001) entry index into VBNC state. The smallest culturability loss rates and also the largest reductions in viable counts were observed for an initial population density of 107 CFU/mL (p<0.05) compared to 105 and 103 CFU/mL. The intracellular protein profile of VBNC S. Enteritidis PT4 963 differed from that observed in the exponential and stationary growth phases, and under osmotic, low temperature, and starvation stresses. The absence of proteins with molecular mass superior to 63 kDa and the presence of proteins with smaller molecular masses in the VBNC state suggest the occurrence of proteolysis, probably to guarantee the maintenance of the nutrient supply and viability. Our results indicate that the VBNC state constitutes a physiologically distinct state within the life cycle of Salmonella enterica serovar Enteritidis PT4. However we could not detect any protein specific of the VBNC cells of Salmonella. The amount of total RNA decreased approximately 600-fold in VBNC cells. No katF, invA, and rpf mRNA was detected in the VBNC populations under the experimental conditions studied. However the 16S rRNA expression was detected in VBNC cells. These results suggest that, considering the 16S rRNA production, VBNC S. Enteritidis PT4 cells are metabolically active and that this housekeeping gene is a good viability marker for Salmonella enterica serovar Enteritidis PT4 in the VBNC state.