Caracterização do mecanismo de sinalização por quorum sensing em Salmonella enterica sorovar Enteritidis

Abstract

Quorum sensing (QS) é um sistema de comunicação entre bactérias dependente da densidade populacional, no qual as bactérias produzem, detectam e respondem a compostos sinalizadores de baixa massa molecular, os autoindutores (AIs). Salmonella apresenta sistemas de QS regulados por três diferentes AIs; AI-1, AI-2 e AI-3, que têm função ainda pouco elucidada. Neste trabalho foram identificados e caracterizados os sistemas de QS mediados pelos AIs 1 e 2 no patógeno humano Salmonella enterica sorovar Enteritidis PT4 578, isolado de carcaça de frango. As análises foram feitas in silico e in vitro. Foi acompanhado o crescimento de Salmonella Enteritidis na presença dos AIs-1sintéticos, as N-acil homoserina lactonas (AHLs): C6-HSL (homoserina lactona), C8-HSL, C10-HSL e C12-HSL e verificou-se que esses AIs não interferiram no crescimento deste patógeno. A confirmação de que Salmonella Enteritidis não sintetiza AI-1 foi feita por análise em cromatografia em camada fina. A partir do genoma de Salmonella Enteritidis PT4, previamente depositado no GenBank, foi confirmado que a regulação do QS mediado pelo AI-2 segue o modelo proposto para Salmonella enterica sorovar Typhimurium. A análise da sequência de nucleotídeos codificadora da proteína SdiA, reguladora do QS mediado pelo AI-1, demonstrou a conservação do gene sdiA neste sorovar. O conhecimento de fenótipos regulados pelo sistema QS pode contribuir para a elucidação de processos importantes na microbiologia de alimentos e permitir a elaboração de estratégias de controle deste patógeno. Portanto, foi avaliada a formação de biofilmes em microplaca de poliestireno por Salmonella na presença de AIs-1 (C6- HSL, C8-HSL, C10-HSL e C12-HSL) na concentração final de 50 nM no meio de cultivo. Foi constatado que, na presença de Ais e, em condições de cultivo em anaerobiose, Salmonella Enteritidis apresentou formação de biofilme mais denso e compacto em superfícies de poliestireno. A C12-HSL foi, dentre as AHLs analisadas, a que apresentou maior interferência nesse fenótipo. A formação de biofilme mais intensa na presença de C12-HSL em superfície de poliestireno também foi constatada por microscopia de varredura e microscopia confocal. Para comprovar a regulação do fenótipo de formação de biofilme pelo AI-1, o experimento foi repetido na presença de uma mistura de diferentes furanonas, inibidores de QS. A redução substancial de células aderidas na presença de furanonas confirma o efeito estimulador dos AIs-1 na formação de biofilmes por Salmonella Enteritidis PT4. Por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real, foi comprovado que C12-HSL promoveu maior expressão dos genes lpfA, fimF, fliF e glgC, de importância para a formação de biofilmes, assim como, dos genes de virulência hilA, invA e invF. Estes resultados evidenciam, pela primeira vez, a função da SdiA na detecção de moléculas sinais produzidas por outras bactérias gram-negativas na modulação de fenótipos importantes para a sobrevivência e virulência de Salmonella Enteritidis.

Quorum sensing (QS) is a population density dependent communication system where bacteria produce, detect and respond to signaling compounds of low molecular weight, called autoinducers (AI), which are released into the environment. Salmonella has QS systems regulated by three different AIs: AI-1, AI-2, and AI-3. In this study, we identified and characterized the QS systems mediated by AI-1 and 2 in the human pathogen Salmonella enterica serovar Enteritidis PT4 578, isolated from chicken carcasses. Analyzes were performed in vitro and in silico. We carried out a growth curve of Salmonella Enteritidis in the presence of synthetic AI-1: C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL and C12-HSL, and we confirmed that AI-1 do not interfere in the growth. The confirmation that Salmonella Enteritidis is not able to synthesize AI-1 came from TLC. Analysis based on the genome of Salmonella Enteritidis PT4, previously deposited in the GenBank, and the described QS system for Salmonella enterica serovar typhimurium we proposed a model for QS regulation mediated by AI-2 for strain PT4 578. Analysis of the nucleotide sequence that encodes SdiA, the regulatory protein of QS mediated by AI-1, demonstrates the conservation of sdiA in this serovar. The knowledge of phenotypes regulated by QS system may contribute to elucidate important processes in food microbiology and to development control strategies for pathogenic and spoilage microorganism. Therefore we evaluated the biofilm formation by Salmonella on polystyrene microtiter plates in the presence of AI-1 (C6-HSL, C8-HSL, C10-HSL and C12-HSL) at final concentration of 50 nM in the culture medium. It was found that in the presence of AIs and on anaerobic conditions, Salmonella Enteritidis showed a higher number of cells adhered on polystyrene surfaces. Among the AHLs analyzed, C12-HSL showed greater interference with this phenotype. Strong biofilm formation in the presence of C12-HSL was also observed on polystyrene surface by scanning electron microscopy and confocal microscopy. We performed tests to evaluate the interference of AIs in combination. In an attempt to verify the regulation biofilm formation, by AI-1 we added a mix of furanones, wich are know QS inhibitors, and a reduced number of adhered cells was observed. Using Real time polymerase chain reaction analysis, it was found that C12-HSL increased the expression of the genes lpfA, fimF, fliF, glgC, wich are important for biofilm formation as well as the hilA, invA and invF virulence genes. These results demonstrate for the first time the function of SdiA for detection of signalling molecules produced by bacteria in the modulation of important phenotypes for the survival of Salmonella Enteritidis.