Alterações nutricionais, fisiológicas e moleculares em clones de eucalipto submetidos à omissão e ao ressuprimento de N ou P

Abstract

A maior EN é atribuída à maior aquisição (EA) e/ou maior utilização (EU) dos nutrientes, processos intermediados por proteínas transportadoras, que respondem de forma diferencial ao suprimento de nutrientes. Além das proteínas, diversas rotas são alteradas em função do suprimento nutricional e em diferentes velocidades. Assim, alterações na coloração, teor nutricional e crescimento são mais lentas do que alterações fisiológicas, que, por sua vez, são mais lentas que as moleculares. Essas diferentes velocidades de alteração, aliadas ao controle genético dessas rotas, unem a nutrição de plantas ao melhoramento genético e podem subsidiar a escolha de materiais genéticos mais eficientes nutricionalmente, bem como indicar biomarcadores nutricionais. Este trabalho visou avaliar as alterações de crescimento, teores nutricionais, variáveis fisiológicas (trocas gasosas, fluorescência da clorofila a e teores de pigmentos), atividade de enzimas chave e expressão de genes candidatos relacionados à maior eficiência de utilização de N ou de P por eucalipto. Mudas de quatro clones (386, I-144, I-042 e VM 01) de eucalipto cresceram em solução nutritiva por 60 dias, quando foram aplicados os tratamentos, constituídos pela omissão de N ou P, por 21 dias, seguido pelo ressuprimento dos mesmos por 14 d e tratamento controle (solução nutritiva sempre completa). Semanalmente foram feitas avaliações de crescimento, fisiológicas e nas semanas 1, 3, 4 e 5 foram coletadas amostras de folhas diagnóstico (folhas jovens totalmente expandidas) para análise do teor total de N e P, atividade das enzimas nitrato redutase (NR EC 1.0.0.1) e glutamina sintetase (GS EC 6.3.1.2), para os tratamentos de N, e fosfatase ácida (APase EC 3.1.3.2) e ribonuclease (RNase EC 3.1.4.22), para os tratamentos referentes a P. Nas semanas 1, 3, 4 e 5 também foram retiradas amostras para determinação do teor dos pigmentos fotossintéticos e realizada leitura de clorofila por clorofilômetro. Na semana 3, período de maior omissão de N ou P, foram coletadas amostras para determinação da expressão dos genes, por PCR- RT (reação de transcriptase reversa em cadeia de polimerase em tempo real) GS2;1, Gln1;3, NR1 e TIP2;1 para N e RNS1 e PHO1;H1 para P. Ao final do ressuprimento foi calculada a massa da matéria seca das plantas, o conteúdo dos nutrientes e as eficiências nutricionais. A omissão/ressuprimento de N causou a menor produção de matéria seca, aumento da EU e queda da EA. Para P houve aumento da EU e queda da EA, embora apenas o clone 386 tenha apresentado menor crescimento, indicando maior adaptação das plantas à falta de P. A omissão levou à queda nos teores de N e aumento na atividade de todas as enzimas e expressão de todos os genes, especialmente o GS2;1 e GLn1;3. A queda na taxa de fotossíntese líquida (A), na omissão de N, pode ser explicada por menores teores de pigmentos e danos na etapa fotoquímica da fotossíntese, pela oxidação do fotossistema II (FS II), além da possível queda no teor da rubisco. Houve queda no teor de P na primeira semana de omissão, e na semana 3, ainda sob a omissão, o teor se igualou ao do tratamento controle, em virtude da alta ciclagem interna, comprovada pelo aumento da atividade das fosfohidrolases e expressão dos genes (PHO1;H1 e RNS1). A queda em A pode ser explicada por danos ao FSII em virtude de menor teor de P inorgânico para a formação de ATP e NADPH, diminuindo a taxa de transporte de elétrons (ETR) e, com isso, a A. A enzima com maior atividade relativa para N foi a GS no clone I-144 (73,6 vezes), reflexo do aumento da expressão do GS2;1. Para P, o maior aumento (16,2 vezes) foi observado para enzima RNase, também para o clone I-144 e comprovado pelo aumento da expressão do RNS1, mostrando controle transcricional deste gene. O ressuprimento tendeu a reestabelecer o status nutricional, variáveis do aparato fotossintético e enzimas relacionadas a N (NR e GS) das plantas, evidenciando grande resiliência do eucalipto. Este padrão se repetiu para P, com exceção das enzimas APase e RNase, cujas atividades ainda eram relativamente altas na semana 5. A resistência/resiliência de clones de eucalipto em resposta à omissão/ressuprimento de N ou P envolve alterações em diversas variáveis, e as que apresentam maior potencial como biomarcadores em eucalipto são: o coeficiente de dissipação fotoquímica (ŶII), taxa de transporte de elétrons, a atividade da enzima GS e expressão dos genes GS2;1 e Gln1;3 quanto ao status de N; taxa fotossintética, enzima RNase e o gene RNS1 quanto ao status de P.

Bigger EN is attributed to a larger acquisition (EA) and/or greater use (EU) of the nutrients and processes intermediated by transporting proteins, that answer in a different way to the supply of nutrients. Beyond proteins, many routes are modified in function of the nutritional supply and in different speeds. Thus, modifications in the coloration, nutritional content and growth are slower than physiological modifications, that, in turn, are slower than molecular ones. These different speeds of modification, united with the genetic control of these routes, join the nutrition of plants to genetic improvement, and can subsidize the choice of more e nutritionally efficient genetic materials, as well as indicating nutritional biomarkers. The objective of this study was to evaluate growth modifications, nutritional, physiological variables (gaseous exchanges, fluorescence of the chlorophyll and the pigment content), activity of key enzymes and expression of candidate genes associated with bigger efficiency of N or P in eucalyptus. Seedling of four clones (386, I-144, I-042 and VM 01) of eucalyptus grew in nutritional solution for 60 days, when the treatments, consisting of the omission of N or P, were applied for 21 days, followed by the resupply of the same for 14 days and controls (always with complete nutritional solution). Weekly, the growth of the plants was evaluated. On weeks 1, 3, 4 e 5, samples of diagnostic leaves were collected (young leaves totally expanded) to analyze the total content of P and N, the activity of reductase nitrate enzymes (NR - EC 1.0.0.1) and glutamine synthetase (GS - EC 6.3.1.2), for the treatments of N, and acid fosfate (APase - EC 3.1.3.2) and ribonuclease (RNase - EC 3.1.4.22) for the treatments of P. In weeks 1, 3, 4 and 5, samples were also taken to determine the content of photosynthetic pigments. Reading of the chlorophyll was also realized with a chlorophyll meter. In week 3, period of the largest omission of N or P, samples were collected to determine the expression of genes, with PCR-RT (reaction of reverse transcriptase in a chain of polymerase in real time) GS2;1, Gln1;3, NR1 e TIP2;1 for N and RNS1 e PHO1;H1 for P. At the end of the resupply, the mass of the dry matter of the plants, the content of the nutrients and the nutritional efficiencies were calculate. The omission/resupply of N caused a smaller production of dry matter, increase of EU and decrease of the EA. For P, there was an increase of EU and fall of EA, even though only clone 386 had presented lesser growth, indicating bigger adaptation of the plants due to the lack of P. The omission led to the fall of levels of N and increase in the activity of all the enzymes and expression of all the genes, especially the GS2; 1 and GLn1; 3. The fall in the level of liquid photosynthesis (A), omitting N, can be explained by lesser levels of pigments and damages in the photochemical stage of the photosynthesis, by the oxidation of photosystem II (FSII), and the possible fall in the level of rubisco. There was a fall in the level of P in the first week of omission. In week 3, still under the omission, the level was equal to the controls, in virtue of the high internal cycling, proven by the increase of the activity of phosphohidrolases and expression of the genes (PHO1;H1 and RNS1). The fall of A can be explained by damages to the FSII because of the lesser level of inorganic P for the formation of ATP and NADPH, diminishing the level of electron transport (ETR) and, with this A. The enzyme with bigger relative activity, for N, was the GS in the I-144 clone (73,6 times), because of the increase of the expression of the GS2; 1. For P, the biggest increase (16,2 times) was observed for RNase enzyme, also for the I-144 clone and proven by the increase of the RNS1, showing transcriptional control of this gene. The resupply tended to reestablish the nutritional status, variable of the photosynthetic apparatus and enzymes related to N (NR and GS) of the plants, evidencing great resilience of the eucalyptus. This pattern happened again for P, with exception of the enzymes APase and RNase, whose activities still were relatively high in week 5. The resistance/resilience of the eucalyptus clones against the omission/resupply of N or P involves alterations in many variables, and those that presented greater potential such as biomarkers in eucalyptus are: the coefficient of photochemical dissipation (YII); level of transportation of electrons; activity of the enzyme GS; and expression of the genes GS2;1 and Gln1;3 as to the status of N; photosynthetic level; RNase enzyme and the gene RNS1 as to the status of P.