Caracterização molecular e funcional de transfatores da família NAC de soja (Glycine max)

Abstract

A identificação de vias de sinalização de resposta a diferentes estresses constitui um dos interesses majoritários de pesquisas na área de interações das plantas com o meio ambiente. Recentemente, foram identificados por nosso grupo genes de soja co-regulados por estresse osmótico e estresse no retículo, que possivelmente fazem parte de uma via integrativa inédita em plantas. Dentre os genes identificados, destacam-se GmATAF2 e GmNAM, que codificam transfatores da família NAC, cujos representantes estão envolvidos em eventos de desenvolvimento vegetal e na resposta a estresses bióticos e abióticos. Nesta investigação, foi demonstrado que as ESTs de GmATAF2 e GmNAM correspondem a regiões distintas de um mesmo gene, homólogo a ATAF1 e ATAF2 de Arabidopsis e denominado GmATAF. Além disso, a expressão transiente de GmATAF em protoplastos de soja resultou na repressão de genes da via integrativa e de genes especificamente induzidos por estresse hídrico e do retículo, sugerindo que GmATAF seja um repressor de vias de resposta a diferentes estresses em soja. Diante do potencial dos transfatores NAC como alvos para estratégias de resistência engenheirada, foram, além de GmATAF, isolados e caracterizados outros 6 genes NACs de soja (GmNAC1-GmNAC6). Os 7 genes GmNACs puderam ser filogeneticamente separados em 6 subgrupos: ATAF1, ATAF2, NAP, ANAC, NAM e TERN, constituindo possivelmente genes NACs funcionalmente não-redundantes. Ensaios de expressão transiente em tabaco revelaram que todas as proteínas GmNAC localizam-se no núcleo, consistentemente com a atuação como fatores de transcrição. Além disso, as proteínas GmNAC2, GmNAC3 e GmNAC5 exibiram capacidade de ativação transcricional em leveduras. Consistentemente com a heterogeneidade funcional sugerida pelo agrupamento filogenético, a análise do padrão de expressão dos genes GmNACs revelou uma expressão diferencial em órgãos de soja. Utilizando plantas transgênicas defeituosas na ativação da via de resposta a proteínas mal dobradas no RE (via UPR), foi demonstrado que a ativação dos genes GmATAF, GmNAC2 e GmNAC6 é sinalizada por estresses no RE por meio de uma via distinta da UPR. Os genes NACs de soja também estão envolvidos na resposta a outros estresses abióticos. Foi demonstrado que GmATAF, GmNAC2, GmNAC3 e GmNAC4 são fortemente induzidos por estresse osmótico, mas possivelmente em vias distintas, pois enquanto GmNAC3 e GmNAC4 são também induzidos pelo hormônio ABA, a indução de GmATAF e GmNAC2 durante o estresse osmótico parece ser independente de ABA. GmNAC3 e GmNAC4 são induzidos também por estresse salino e por ácido jasmônico, mas não por baixas temperaturas. Consistentemente com o envolvimento em morte celular, os genes GmATAF, GmNAC1 e GmNAC6 são induzidos por indutores de morte celular e reprimidos por inibidores de senescência. Além disso, a expressão transiente de GmNAC1, GmNAC5 e GmNAC6 em folhas de tabaco resultou em morte celular e ativou a expressão do gene marcador de senescência CP1. A análise da expressão gênica em folhas de soja senescentes sugere que, enquanto GmNAC1 está associado à progressão da senescência, GmNAC5 e GmNAC6 induzem outras formas de morte celular, como as que ocorrem durante o desenvolvimento do embrião e na reposta hipersensível. Coletivamente, estes resultados indicam que os genes NACs caracterizados constituem fatores de transcrição envolvidos na resposta a estresses abióticos e participam em eventos de morte celular em soja.

The identification of cell signaling pathways in response to different stresses has become a major focus for understanding the molecular bases of plantenvironment interactions. We have previously identified a set of soybean genes co-regulated by ER- and osmotic stresses, which possibly constitute a novel integrative pathway in plants. Among the identified genes, GmATAF2 and GmNAM encode transcription factors from the NAC-family, whose representatives are involved in events of plant development and response to biotic and abiotic stresses. In this study, we demonstrated that the ESTs of GmATAF2 and GmNAM correspond to different regions of the same gene, homologous to Arabidopsis ATAF1 and ATAF2 and named GmATAF. Furthermore, GmATAF transient expression in soybean protoplasts resulted in the repression of the integrative genes and genes specifically induced by dehydration and ER stress, suggesting that GmATAF is a repressor of different stress-responsive pathways in soybean. Given the potential of NAC transfactors as targets for strategies of engineered resistance, in addition to GmATAF, we isolated and characterized other 6 soybean NAC genes (GmNAC1- GmNAC6). The 7 GmNAC genes could be phylogenetically separated into 6 subgroups: ATAF1, ATAF2, NAP, ANAC, NAM and TERN, possibly representing non-redundant NAC genes. Transient expression experiments in tobacco plants revealed that all GmNAC proteins were located in the nucleus, consistent with their roles as transcription factors. Moreover, GmNAC2, GmNAC3 and GmNAC5 proteins exhibited transcriptional activity in yeast. Consistent with a functional diversity suggested by the phylogenetic analysis, the GmNAC genes displayed a differential expression pattern in soybean organs. Using transgenic plants defective for the unfolded protein response (UPR) activation, we demonstrated that activation of GmATAF, GmNAC2 and GmNAC6 genes occurs via an ER-stress signaling pathway distinct from the UPR. The NAC soybean genes are also involved in the response to other abiotic stresses. We demonstrated that GmATAF, GmNAC2, GmNAC3 and GmNAC4 are strongly induced by osmotic stress, though possibly through different pathways. While GmNAC3 and GmNAC4 are also induced by the hormone ABA, the induction of GmATAF and GmNAC2 during osmotic stress seems to be ABA-independent. GmNAC3 and GmNAC4 are also induced by salinity and jasmonic acid, but not by low temperatures. Consistent with an involvement in cell death programs, GmATAF, GmNAC1 and GmNAC6 genes were up-regulated by cell death inducers and repressed by senescence inhibitors. Furthermore, the transient expression of GmNAC1, GmNAC5 and GmNAC6 in tobacco leaves resulted in cell death and enhanced the expression of the senescence gene marker CP1. Gene expression analysis of senescent soybean leaves suggests that GmNAC1 is associated with senescence progression, while GmNAC5 and GmNAC6 is more likely to be involved in other forms of cell death, such as embryo development-induced cell death and the hypersensitive response. Collectively, these results indicate that the characterized NAC genes consist of transcription factors involved in response to different abiotic stresses and take part in cell death events in soybean.