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Expressão heteróloga e caracterização bioquímica da proteína recombinante GmSBP2/S64 da soja (Glycine max)

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dc.creator Luz, Dirce Ferreira
dc.date.accessioned 2015-03-26T12:15:23Z
dc.date.available 2006-11-07
dc.date.available 2015-03-26T12:15:23Z
dc.date.issued 2006-06-09
dc.identifier.citation LUZ, Dirce Ferreira. Heterologous expression and biochemical characterization of GmSBP2/S64 recombinant protein from soybean (Glycine max). 2006. 87 f. Tese (Doutorado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2006. por
dc.identifier.uri http://locus.ufv.br/handle/123456789/333
dc.description.abstract A proteína de ligação à sacarose (SBP) pertence à família das proteínas cupim e é relacionada estruturalmente às proteínas de armazenamento do tipo vicilinas. Nesta investigação, a SBP foi expressa em E. coli e grandes quantidades da proteína foi acumulada na fração insolúvel como agregados, proteína desnaturada. A renaturação da proteína purificada se deu com a remoção progressiva da uréia no tampão de renaturação, que continha um sistema de retirada de óxido (2 mM de glutationa reduzida e 0,2 mM de glutationa oxidada) e glicerol 5% (v/v) como um agente estabilizador de proteína. A renaturação da proteína foi monitorada usando o dicroísmo circular na faixa do UV distante (CD), a fluorescência intrínseca, e o apagamento por acrilamida, KCl e KI. A porcentagem da estrutura secundária da proteína renaturada, que foi calculada com base no espectro de CD, foi consistente com aquela obtida pelo modelamento teórico com grande predominância da estrutura de beta barril (42%) sobre a alfa-hélice (9,9%). O máximo da emissão de fluorescência de 303 nm para a SBP indicou que o triptofano fluorescente foi completamente internalizado dentro de um ambiente altamente hidrofóbico. Não obstante, o apagamento do triptofano pela acrilamida, KI e CsCL e respectiva constante de Stern-Volmer (Ksv) de 23,5 +- 0,5 M-1, 16,1 +- 0,2 M-1 e 4,9 +- 0,1 M-1 indicam que os resíduos de triptofano fluorescentes foram bastante acessíveis aos apagadores e, conseqüentemente, expostos ao solvente. Foi medida também a constante de dissociação de equilíbrio (Kd) da ligação da sacarose por titulação da fluorescência usando a proteína renaturada. A baixa afinidade de ligação da sacarose (Kd = 2,79 +- 0,22 mM) à proteína renaturada foi similar àquela da proteína nativa purificada das sementes de soja. Coletivamente, os resultados apontam que a estrutura enovelada da proteína renaturada é similar à proteína SBP nativa. Como um membro da família das proteínas bicupim que incluem proteínas de armazenamento de semente altamente estáveis, foi de interesse determinar a estabilidade estrutural da SBP. As desnaturações térmicas e químicas da proteína foram examinadas por monitoramento das mudanças nos espectros de CD e na fluorescência intrínseca da proteína renaturada. Os resultados indicam que a SBP permaneceu enovelada em uma extensão similar na presença ou ausência de 8 M de uréia ou de 6 M de GdnHCl. Do mesmo modo, foi razoavelmente estável em altas temperaturas. A alta estabilidade da proteína renaturada pode ser uma propriedade remanescente da SBP de seu parentesco evolucionário com as proteínas de armazenamento de sementes. pt_BR
dc.description.abstract The sucrose binding protein (SBP) belongs to the cupin family of proteins and is structurally related to vicilin-like storage proteins. In this investigation, SBP was expressed in E. coli and large amounts of the protein accumulated in the insoluble fraction as aggregated, denatured protein. The refolding of the purified protein proceeded with a progressive removal of urea into the renaturation buffer, which contained an oxido shuffling system (2 mM reduced glutathione and 0.2 mM oxidized glutathione) and glycerol 5% (v/v) as a proteinstabilizing agent. The renaturation of the protein was assayed by using far-UV circular dichroism (CD), intrinsic fluorescence, and quenching by acrylamide, KCl and KI. The percentage of secondary structure of the renatured protein, which was calculated on the basis of the CD spectrum, was consistent with that obtained by theoretical modeling with a large predominance of beta-strand structure (42%) over the alfa-helix (9.9%). The fluorescence emission maximum of 303 nm for SBP indicated that the fluorescent tryptophan was completely buried within a highly hydrophobic environment. Nevertheless, tryptophan quenching by acrylamide, KI and CsCL and the respective Stem-Volmer (Ksv) constant of 23.5 +- 0.5 M-1, 16.1 +- 0.2 M-1 and 4.9 +- 0.1 M-1 indicate that the fluorescent tryptophan residues were quite accessible to the quenchers and hence exposed to the solvent. We also measured the equilibrium dissociation constant (Kd) of sucrose binding by fluorescence titration using the refolded protein. The low sucrose binding affinity (Kd = 2.79 +- 0.22 mM) of the renatured protein was similar to that of the native protein purified from soybean seeds. Collectively, our results indicate that the folded structure of the renatured protein is similar to the native SBP protein. As a member of the bicupin family of proteins which include highly stable seed storage proteins, it was of interest to determine the structural stability of SBP. The thermal and chemical denaturations of the protein were examined by monitoring changes in the CD spectra and in the intrinsic fluorescence of the renatured protein. Our results indicate that SBP remained folded to a similar extent in the presence or absence of 8 M urea or 6 M GdnHCl. Likewise, it was fairly stable to high temperatures. The high stability of the renatured protein may be a eminiscent property of SBP from its evolutionary relatedness to the seed storage proteins. eng
dc.description.sponsorship Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
dc.format application/pdf por
dc.language por por
dc.publisher Universidade Federal de Viçosa por
dc.rights Acesso Aberto por
dc.subject Proteína recombinante por
dc.subject Dicroísmo circular por
dc.subject Fluorescência por
dc.subject Recombinant protein eng
dc.subject Circular dichroism eng
dc.subject Fluorescence eng
dc.title Expressão heteróloga e caracterização bioquímica da proteína recombinante GmSBP2/S64 da soja (Glycine max) por
dc.title.alternative Heterologous expression and biochemical characterization of GmSBP2/S64 recombinant protein from soybean (Glycine max) eng
dc.type Tese por
dc.contributor.advisor-co1 Pereira, Maria Cristina Baracat
dc.contributor.advisor-co1Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4780021E6 por
dc.contributor.advisor-co2 Oliveira, Marli Lourdes de
dc.contributor.advisor-co2Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4776566H8 por
dc.publisher.country BR por
dc.publisher.department Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal por
dc.publisher.program Doutorado em Bioquímica Agrícola por
dc.publisher.initials UFV por
dc.subject.cnpq CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR por
dc.creator.lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4706238T7 por
dc.contributor.advisor1 Fontes, Elizabeth Pacheco Batista
dc.contributor.advisor1Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4781848H2 por
dc.contributor.referee1 Rezende, Sebastião Tavares de
dc.contributor.referee1Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787599A3 por
dc.contributor.referee2 Martín, Francisco Javier Medrano
dc.contributor.referee2Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4777240H8 por


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  • Bioquímica Agrícola [208]
    Teses e dissertações defendidas no Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola

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