Obtenção e caracterização de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum com alta produção de pectina liase e poligalacturonase

Abstract

Penicillium griseoroseum foi descrita como uma espécie promissora para a produção de poligalacturonase (PG) e pectina liase (PL). No entanto, os genes que codificam estas enzimas em P. griseoroseum requerem indução por pectina e sofrem repressão catabólica na presença de glicose. Uma estratégia para aumentar a expressão destes genes é a substituição do promotor endógeno por um promotor forte e constitutivo. Desse modo, para se obter linhagens com alta produção de poligalacturonase e pectina liase, sem a necessidade de indução, foi feita a co-transformação da linhagem recombinante 105, que possui cópias adicionais do gene plg1 sob controle do promotor do gene gpd de A. nidulans, utilizando-se os plasmídeos pAN52pgg2 e pAN7.1. As linhagens recombinantes obtidas apresentaram, pelo menos, uma cópia do pAN52pgg2 integrada no genoma. A linhagem mitoticamente estável, denominada recombinante R20 de P. griseoroseum, foi selecionada por apresentar a maior produção de PG e PL em comparação com as demais linhagens recombinantes obtidas. Esta linhagem apresentou uma elevada produção de poligalacturonase e pectina liase, quando cultivada em presença de glicose, sacarose ou caldo de cana. Aumentos de 11 vezes na atividade de PG e de 45 vezes na atividade de PL ocorreram, quando a linhagem recombinante R20 foi cultivada em caldo de cana, em relação à linhagem selvagem cultivada em condições ótimas de produção. A maior produção de PG, PL e massa micelial seca pela linhagem recombinante R20 foi obtida, quando se utilizou inóculo de 106 conídios/mL, concentração de glicose 1% (p/v), volume de 200 mL de meio de cultivo em Erlenmeyers de 500 mL e tempo de cultivo de 72 a 96 horas, sob agitação de 150 RPM a 25ºC. No perfil protéico da linhagem recombinante R20 evidenciou-se a presença de duas bandas de proteínas distintas com aproximadamente 38 e 36 kDa, que correspondem a PG e a PL, respectivamente. A linhagem apresentou baixa atividade de protease no período final de cultivo, enquanto a atividade celulolítica não foi detectada nas condições avaliadas. Além disso, a linhagem recombinante R20 teve uma secreção de 18 mg de proteína total/L em 120 horas de cultivo, sendo pectina liase e poligalacturonase preferencialmente secretadas. Os resultados são úteis para a condução de experimentos de otimização em larga escala e posterior aplicação da linhagem recombinante R20 na indústria de produção de pectinases.

Penicillium griseoroseum has been described as a promising species for polygalacturonase (PG) and pectin lyase (PL) production. However, the genes encoding these enzymes in this organism require induction by pectin and are repressed by glucose. One strategy to increase the expression of these genes is the replacement of original promoter by a strong constitutive one. Thus, in order to obtain PG and PL overproducing strains with no need of pectin induction, we performed the co-transformation of previously described recombinant T105, a strain that contains additional copies of plg1 gene under the control of gpdA promoter from Aspergillus nidulans, using the plasmids pAN52pgg2 and pAN7.1. The resulting strains showed at least one copy of pAN52pgg2 into the genome. A genetically stable strain, named recombinant R20 was chosen for further characterization because of its high levels of PG and PL activity compared to the other recombinant strains obtained. This strain exhibited elevated production of both enzymes when cultivated in presence of glucose, sucrose or sugar cane juice. Increases of up to 11 times in PG activity and 45 times in PL activity were detected when the recombinant R20 was cultivated in sugar cane juice, in comparison with the wild type strain grown in optimized production conditions. The maximum production of PG, PL, and dry mycelium mass by recombinant strain was observed in the following conditions: inoculum of 106 conidia.mL-1, 1% glucose, 200 mL of culture medium in 500 mL Erlenmeyer flasks, and incubation time of 72 to 96 hours under agitation of 150 RPM at 25oC. Denaturing SDS-PAGE of the recombinant R20 culture filtrate revealed the presence of two protein bands of about 38 and 36 KDa corresponding to PG and PL, respectively. In addition, this strain secreted 18 mg of total protein per liter of culture medium in 120 hours of incubation, being PG and PL the main protein secreted. These results will be valuable for the setting of enzyme production experiments in large scale and ultimately in the application of R20 strain for industrial production of pectinases.