Uso da própolis e do ácido ascórbico na criopreservação do sêmen caprino

Abstract

Os objetivos deste estudo foram verificar se a própolis e o ácido ascórbico têm efeito sobre a integridade da membrana plasmática dos espermatozóides de caprinos, bem como, investigar o potencial destes antioxidantes no uso de meios diluidores de criopreservação de sêmen caprino. Foram utilizados cinco bodes adultos das raças Alpina (n = 2) e Saanen (n = 3). Para as coletas de sêmen, utilizou-se a vagina artificial, onde se obteve cinco ejaculados por animal. Após a coleta, fez-se o exame físico do sêmen e morfológico dos espermatozóides, teste supravital e teste hiposmótico. Em seguida, o sêmen in natura foi diluído, homogeneizado, dividido em cinco alíquotas iguais e centrifugados. O sobrenadante foi desprezado e cada pellet de espermatozóides foi ressuspendido com diluente, de acordo com os tratamentos: T1 (BIOXCELL® - CONTROLE); T2 (BIOXCELL® + 0,25% de extrato liofilizado de própolis); T3 (BIOXCELL® + 0,5% de extrato liofilizado de própolis); T4 (BIOXCELL® + 0,05% de ácido ascórbico; e T5 (BIOXCELL® + 0,25% de ácido ascórbico). Após as diluições finais, foram avaliados a motilidade e o vigor espermático de cada tratamento, e posterior envase. As palhetas foram resfriadas a 4 - 5 ºC, durante 35 minutos em refil de plástico contendo álcool metílico, e posteriormente, 25 minutos fora do mesmo. O pré-congelamento foi realizado em vapor de nitrogênio líquido, durante 14 minutos. Após esse período, as palhetas foram imersas no nitrogênio para o congelamento final do sêmen. As doses foram descongeladas em banho-maria a 37 °C por 30 segundos, e acondicionadas em tubos plásticos de 1,5 mL e homogeneizados para análise imediata de motilidade e vigor espermático, teste supravital, teste hiposmótico e teste de termo-resistência. No sêmen in natura, os aspectos físicos e morfológicos, teste supravital e teste hiposmótico não diferiram (P>0,05) entre os animais e entre raças. Não houve correlação do aspecto e do turbilhonamento com as demais variáveis. Houve correlação média e negativa (r= -0,46) entre o volume e o teste hiposmótico. A motilidade espermática apresentou correlação média e positiva com vigor (r = 0,52) e o teste supravital (r = 0,55). Houve correlação alta e positiva (r = 0,73 e 0, 69) entre defeitos espermáticos maiores e menores com os defeitos totais. Houve relação média e negativa (r = -0,40) entre os defeitos espermáticos maiores e o teste hiposmótico, não sendo observado com os defeitos menores. Não houve diferença (P>0,05) entre as médias da motilidade espermática do sêmen diluído (pré- resfriamento), em todos os tratamentos, porém, as médias do vigor espermático do sêmen diluído apresentaram diferença (P<0,05) entre os tratamentos, onde o T1 e T3 foram diferentes do T4 e iguais aos T2 e T5. As médias gerais da motilidade e do vigor espermático nos tratamentos logo após o descongelamento e após três horas de TTR diferiram entre si (P<0,05), onde T4, T5 e T1 foram similares e superiores aos T2 e T3. Os valores médios gerais observados no teste supravital e no teste hiposmótico pós- descongelamento diferiram (P<0,05) entre os tratamentos, em que T4, T5 e T1 foram similares e superiores ao T2 e ao T3. Os valores obtidos no teste supravital apresentaram correlação alta e positiva com a motilidade espermática, em todos os tratamentos. Nos T1, T4 e T5 houve correlação alta e positiva (r = 0,63; r = 0,64; r = 0,71; respectivamente) entre os valores registrados nos testes supravital e hiposmótico. Os valores observados no teste hiposmótico e a motilidade espermática apresentaram correlação alta e positiva nos T1 (r = 0,78) e T5 (r = 0,65) e correlação média e positiva no T4 (r = 0,44). Tanto no momento do descongelamento (0 hora) quanto ao final do TTR (3 horas), o teste supravital e a motilidade espermática do sêmen in natura não apresentaram correlação com as motilidades espermáticas dos tratamentos deste estudo. Porém, no momento do descongelamento, os valores médios observados no teste hiposmótico do sêmen in natura apresentaram correlação média e positiva com a motilidade espermática do T1 e T2, e correlação alta e positiva com a motilidade espermática do T5. Da mesma forma, às 3 horas de TTR, verificou-se correlação média e positiva com a motilidade espermática do T1, T4 e T5. Concluiu-se que: o ácido ascórbico manteve a integridade estrutural da membrana dos espermatozóides durante o processo de criopreservação, bem como sua viabilidade após o teste de termo-resistência, podendo ser uma alternativa na composição de diluentes para criopreservação de sêmen caprino; a própolis não se mostrou eficaz na manutenção da integridade e viabilidade espermática pós-descongelamento, mostrando ser tóxica aos espermatozóides nas concentrações de 0,25 e 0,5 %; o teste hiposmótico realizado no sêmen in natura se mostrou eficaz em predizer a congelabilidade da amostra de sêmen, bem como, sua viabiliadade ao final do teste de termo-resistência de três horas.

The objectives of this study were to verify if the propolis and ascorbic acid contain effect on plasmatic membrane integrity of goats spermatozoa as well as investigate the potential of these antioxidants on the use of goats spermatozoa cryopreservation extenders. Semen from five adults goats were used, totalizing 5 semen samples for each one. After semen collection, the evaluation consisted of physical and morphological exam, live and dead cells (supravital test) and hyposmotic swelling test. Afterwards, the fresh semen was diluted, homogenized, divided on 5 equal parts and centrifuged. The spermatozoa pellet was raised with respective treatment: T1 (BIOXCELL® - CONTROL); T2 (BIOXCELL® + 0,25% of propolis extract); T3 (BIOXCELL® + 0,5% of propolis extract); T4 (BIOXCELL® + 0,05% of ascorbic acid); e T5 (BIOXCELL® + 0,25% of ascorbic acid). After final dilutions, it was evaluated the sperm motility and vigor on each treatment, and posterior seal. The straws were cooled at 4 - 5 °C during 35 minutes in a plastic container containing methyl alcohol and 25 minutes out of container. The pre-freezing was done in liquid nitrogen vapour, during 14 minutes. Then, the straws were immersed in nitrogen. The thawing of the samples was made by immersion of the straws in a 37 °C water-bath for 30 minutes to evaluate the sperm motility and vigor, supravital test, hyposmotic swelling test and thermoresistence test. In fresh semen, the physical and morphological aspects, supravital test and hyposmotic swelling test not differ (P>0,05) between animals and between races. There was no correlation of appearance and whirlpool with other variables. There was mean and negative correlation (r = -0,46) between the volume and hyposmotic swelling test. The sperm motility showed average and positive correlation with sperm vigor (r = 0,52) and supravital test (r = 0,55). There was high and positive correlation (r = 0,73 and 0, 69) between major and minor defects sperm with defects totals. There was mean and negative correlation (r = -0,40) between major defects sperm and hyposmotic swelling test, not being seen with the minor defects. The average sperm motility of the diluted semen (pre-cooling) of all treatments, showed no difference between them (P>0,05), however, the averages of sperm vigor of diluted semen showed difference (P<0,05) among treatments, where the T1 and T3 were different from T4 and equals to T2 and T5. The general average of motility and vigor sperm on treatments immediately after thawing and after three hours of thermoresistence test differed among themselves (P<0,05), where the T4, T5 and T1 were similar and higher than T2 and T3. The general average values observed in supravital test and hyposmotic swelling test post-thawing differed (P<0,05) among treatments, in which the T4, T5 and T1 were similar and higher than T2 and T3. The values observed on supravital test showed high and positive correlation with sperm motility in all treatments. In T1, T4 and T5 had high and positive correlation (r = 0,63; r = 0,64; r = 0,71; respectively) between the values in supravital test and hyposmotic test. The values observed in the hyposmotic test and sperm motility showed high and positive correlation in T1 (r = 0,78) and T5 (r = 0,65) and correlation mean and positive in T4 (r = 0,44). Both at the time of thawing (0 hour) as the end of the thermoresistence test (3 hours), the supravital test and sperm motility showed no correlation with the motility sperm of treatments this study. But at the time of thawing, the average values observed in hyposmotic test of fresh semen showed average and positive correlation with sperm motility of T1 and T2, and high and positive correlation with the T5 motility sperm. Similarly, at 3 hours of thermoresistence test, there was average and positive correlation with sperm motility of T1, T4 and T5. It was concluded that: the ascorbic acid maintained structure integrity of the spermatozoa membrane during cryopreservation process as well as its viability after thermoresistence test, and may be an alternative in the composition of extenders for cryopreservation of semen goats; the propolis was not effective in maintaining the integrity and viability sperm after thawing, showing to be toxic to spermatozoa at concentrations of 0,25 and 0,5%; and the hyposmotic test in fresh semen was effective in predicting the semen freeze, as well as, its viability in the end of the thermoresistence test of three hours.