Compostos de reserva e permeabilização de basidiósporos de Pisolithus microcarpus

Abstract

Os basidiósporos Pisolithus apresentam baixas percentagens de germinação, embora disponham de compostos de reserva para a provisão de carbono e energia durante o crescimento inicial das hifas. Neles, a parede celular altamente hidrofóbica e resistente pode contribuir para a recalcitrância à germinação. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo demonstrar a presença de glicogênio, polissacarídeo, lipídeos, RNA e proteínas em basidiósporos maduros de Pisolithus microcarpus, determinar o perfil de ácidos graxos de basidiósporos de fungos ectomicorrízicos e avaliar métodos de permeabilização da parede celular dos basidiósporos. As técnicas histoquímicas utilizadas na detecção de diferentes compostos de reserva nos basidiósporos evidenciaram a presença de glicogênio, polissacarídeos, proteínas, RNA, lipídeos totais, lipoproteínas, lipídeos neutros e lipídeos ácidos. Detectou-se a presença de onze ácidos graxos distintos nos basidiósporos de P. microcarpus, nove nos de Scleroderma sp. e dezesseis nos de Suillus sp. Os ácidos graxos mais abundantes nas estruturas fúngicas analisadas foram o 18:1w9c e o 16:0. Além do ácido oléico e ácido palmítico, destacaram-se os seguintes ácidos graxos: 16:1w5c, 18:1w5c para P. microcarpus; 12:1at11-12 e 18:00 para Scleroderma sp.; 18:00 e 15:00 para Suillus sp. O perfil de ácidos graxos dos basidiósporos de P. microcarpus apresentou similaridade de 36,8 % com o de Scleroderma sp. O perfil de ácidos graxos dessas duas espécies apresentou similaridade de somente 5,2 % em relação àquele de Suillus sp. O uso de quitinase, liticase e celulase por 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12 e 24 h, sob agitação a 80 rpm e a 30 °C, não resultou na permeabilização da parede celular dos basidiósporos. O tratamento dos basidiósporos com ácido sulfúrico nas concentrações de 5, 10, 25, 50 % (v/v), por 5, 10, 25, 50 ou 80 s, também não resultou na permeabilização dos basidiósporos. Os tratamentos com hipoclorito de sódio em concentrações de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 90 e 100 % da concentração original de cloro ativo (20 g L- 1) e tempos de contato de 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e 80 s promoveram a permeabilização da parede celular dos basidiósporos avaliada pela penetração do corante Negro Sudão B. A maior percentagem de basidiósporos permeabilizados, 97 %, foi obtida com o tratamento com hipoclorito a 100 % pelo tempo de 80 s. No entanto, os testes de viabilidade e a observação dos basidiósporos por microscopia eletrônica de varredura evidenciaram a perda da integridade da parede celular e da viabilidade dos esporos quando submetidos a esse tratamento. A exposição dos basidiósporos ao hipoclorito de sódio a 5 % pelo tempo de 40 s foi o tratamento que resultou em maiores percentagens (83 %) de basidiósporos permeabilizados, sem prejuízos na viabilidade e da morfologia desses propágulos. Os resultados obtidos contribuem para a compreensão das variáveis que atuam no processo de germinação dos basidiósporos de P. microcarpus e permitirão o desenvolvimento de estratégias visando melhorar a obtenção de monocários in vitro.

The basidiospores of Pisolithus show low germination percentages despite possessing conspicuous reserve compounds for the provision of carbon and energy during the initial growth of the fungal hyphae. The highly hydrophobic and resistant cell wall of the basidiospore can contribute to basidiospores recalcitrance to germination. Thus, this study aimed at demonstrating the presence of glycogen, polysaccharides, lipids, RNA and proteins in mature basidiospores of Pisolithus microcarpus, determining the fatty acid profile of the basidiospores of ectomycorrhizal fungi, and evaluating methods of permeabilization of the basidiospore cell wall. Hystochemical techniques used in the detection of different reserve compounds in the basidiospores revealed the presence of glycogen, polysaccharides, proteins, RNA, lipids, lipoproteins, neutral lipids, and acidic lipids. The presence of 11 different fatty acids in the basidiospores of P. microcarpus, nine in those of Scleroderma sp. and 16 in the basidiospores of Suillus sp. was observed in our study. The most abundant fatty acids in the fungal basidiospores were 18:1w9c and 16:0. Besides oleic and palmitic acids, the following fatty acids showed significant contents: 16:1w5c 16:0, 18:1w5c for P. microcarpus; 12:1 AT11-12, 18:00 for Scleroderma sp.; 15:00 and 18:00 for Suillus sp. The fatty acid profile of the basidiospores of P. microcarpus showed 36.8 % similarity to that of Scleroderma sp. The fatty acid profile of these two species showed a similarity of only 5.2 % compared to that of Suillus sp. The use of chitinase, cellulase, and lyticase for 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, and 24 h, at 30 °C, under stirring at 80 rpm, and of sulfuric acid at concentrations of 5, 10, 25, 50 % (v / v) for 5, 10, 25, 50 or 80s did not promote cell wall permeability. The treatment with sodium hypochlorite at concentrations of 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 90 and 100 % of original concentration of active chlorine (20 g L-1) and contact times of 5, 10 , 20, 30, 40, 50, 60, 70, and 80s promoted the permeabilization of the basidiospore cell wall as evaluated by the staining of internal fatty acids with Sudan Black B. The highest percentage of permeabilized basidiospores, 97 %, was obtained with the treatment with hypochlorite at 100 % for 80s. However, the viability tests and the observation of basidiospores by scanning electron microscopy revealed the loss of viability and cell wall integrity. The exposure of the basidiospores to sodium hypochlorite at 5 % for 40s promoted the highest percentages of permeabilized basidiospores, 83 %, without loss of viability and morphological damages to the spore cell wall. These results contribute to the understanding of the variables that may play a role in the process of germination of basidiospores of P. microcarpus and allow the development of strategies to improve the isolation of monokaryons in vitro.