Serratia and Pseudomonas as important heat-resistant protease producers in cold raw milk

Abstract

The storage of raw milk at cold temperatures does not prevent growth of psychrotrophic bacteria, which can produce heat-resistant proteases that compromise the quality and reduce the shelf life of dairy products. To minimize the technological problems resulting from proteolytic activity, these enzymes should be detected and quantified in raw milk before processing by a rapid method. However, there is no efficient method for this purpose. This work aimed to identify the predominant psychrotrophic species with spoilage potential in Brazilian raw milk, to identify and characterize the heat-resistant proteases produced by this microbiota and to developed a rapid method to detect these proteases in raw milk samples. The cold storage conditions were simulated and the psychrotrophic proteolytic bacteria isolated. The heat-resistant protease-producing bacteria were typing by Rep-PCR and clustered. Biochemical tests, 16S rDNA and rpoB gene sequencing were used for identifying one representative isolate from each cluster. The heat-resistant protease produced by Serratia liquefaciens was characterized. The encoding gene was identified after mass spectrometry analysis of tryptic peptides from the heat-resistant protease. The biotinylated casein was coated on microtiter plates and used as substrate to quantify proteolytic activity in solution and milk samples. Highly proteolytic strains were identified and characterized. The isolates were separated into eight different clusters and four solitary fingerprints. The most proteolytic isolates belonged to Serratia liquefaciens and Pseudomonas species. The S. liquefaciens isolates may produce Ser2, which is a a metalloprotease resistant to the heat treatment of 95 °C for 8.45 min. This metalloprotease showed a molecular weight of approximately, 52 kDa and a heat- resistance similar to AprX from Pseudomonas spp. Although nucleotide sequences of ser2 gene were conserved among S. liquefaciens isolates, the spoilage potential among them was heterogeneous indicating differences in enzyme expression levels or post-transcriptional modifications. The developed immunoassay was efficient for quantification of trypsin, papain, pepsin, thermolysin and protease from bovine x pancreas activity. However, further research should be performed to minimize the influence of milk components on the developed assay for detecting proteases in milk samples. This work highlighted the poor conditions of hygiene in milk farms and the high spoilage potential of the microbiota found in raw milk samples besides the development of a promising assay for detection and quantification of proteolytic activity useful for dairy industry.

A estocagem de leite cru sob temperatura de refrigeração não impede o crescimento de bactérias psicrotróficas produtoras de proteases termorresistentes que comprometem a qualidade e reduzem a vida de prateleira de produtos lácteos. Para minimizar os problemas tecnológicos resultantes da atividade proteolítica, é desejável que proteases sejam detectadas e quantificadas em leite cru por um método rápido. No entanto, não existe um método eficiente para este fim. Este trabalho teve como objetivos identificar as espécies psicrotróficas com potencial de deterioração predominantes em leite cru brasileiro; identificar e caracterizar as proteases resistentes ao calor produzidas por esta microbiota e desenvolver um método rápido para detectar estas proteases em amostras de leite. As condições de armazenamento sob refrigeração foram simuladas e as bactérias psicrotróficas proteolíticas foram isoladas. As bactérias produtoras de proteases termorresistentes foram agrupadas após análise por Rep-PCR. Os testes bioquímicos e o sequenciamento dos genes rDNA 16S e rpoB foram utilizados para identificar representantes de cada grupo. Uma protease termorresistente produzida por Serratia liquefaciens foi caracterizada e o gene que codifica esta enzima foi identificado após análise dos peptídeos trípticos da protease por espectrometria de massa. Placas de microtitulação revestidas com caseína marcada com biotina foram utilizadas para quantificar a atividade proteolítica de amostras de leite e de proteases diluídas em solução tampão. Os isolados bacterianos altamente proteolíticos foram separados em oito grupos diferentes e quatro padrões únicos. Os isolados com potencial proteolítico são correspondentes à espécie Serratia liquefaciens e ao gênero Pseudomonas. Isolados de S. liquefaciens podem produzir uma metaloprotease termorresistente ao tratamento de 95 °C por 8,45 min, identificada como Ser2, com massa molar de, aproximadamente, 52 kDa e semelhante à protease AprX de Pseudomonas spp. Embora sequências de nucleotídeos do gene ser2 sejam conservadas entre os isolados de S. liquefaciens, o potencial de deterioração das estirpes é heterogêneo indicando diferenças nos níveis de expressão gênica, enzima viii ou modificações pós-transcricionais. O imunoensaio desenvolvido neste estudo foi eficiente para a quantificação da atividade de tripsina, papaína, pepsina, termolisina e protease de pâncreas bovino. No entanto, novas pesquisas devem ser realizadas para minimizar a influência dos componentes da amostra de leite nesta técnica para permitir a detecção acurada de proteases. Este trabalho destaca o elevado potencial de deterioração da microbiota encontrada em amostras de leite cru, além do desenvolvimento de um ensaio promissor, útil para a indústria de lacticínios, para detecção e quantificação de atividade proteolítica resultante das práticas agrícolas inadequadas nas propriedades produtoras de leite.