Embriogênese somática em Passiflora cincinnata Mast. e P. setacea D.C.: caracterização morfo-anatômica, mobilização de reservas e expressão dos genes SERK e BBM

Abstract

A aquisição de competência embriogênica por células somáticas é um processo intrigante e necessita da junção de dados genético-moleculares e citológicos para melhor compreensão dos mecanismos e mudanças celulares envolvidas. À vista disso, os objetivos desse trabalho foram isolar e caracterizar o padrão de expressão dos genes SERK e BBM por hibridização in situ durante o processo de embriogênese somática em Passiflora cincinnata, avaliar a responsividade morfogênica in vitro de P. setacea e P. cincinnata submetidas a condições de indução de embriogênese somática, bem como, acompanhar a mobilização de reservas e a expressão dos genes supracitados durante a embriogênese somática. Para tal, a partir de calos embriogênicos de P. cincinnata, com 20 dias em meio de indução (MI), extraiu-se o RNA total e obteve-se o cDNA, o qual serviu como molde para amplificação da sequência codante utilizando-se primers degenerados para SERK e BBM. A responsividade de embriões zigóticos maduros de P. setacea e P. cincinnata foi avaliada mediante o cultivo em meio de indução alternativo constituído por sais MS suplementado com 31,06 μM de Picloram + 2,22 μM de BA + 2,27 μM de TDZ (MIP) + 500 mg L -1 de Extrato de Malte (EM) + 13,77 μM de Espermidina (Spd). Após 30 dias as culturas foram transferidas ao meio de maturação (MM) composto de meio MS acrescido de 1,0% de carvão ativado e ausência de reguladores de crescimento. Amostras com 0, 10, 20 e 30 dias foram coletadas para microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, testes histoquímicos e hibridização in situ, todas seguindo protocolos específicos. Para visualização da expressão dos genes SERK e BBM foi gerada uma sonda de RNA a partir de um clone sequenciado de P. cincinnata. Para P. setacea utilizou-se uma sonda heteróloga sense e antisense de P. cincinnata. O relacionamento filogenético das sequências isoladas de P. cincinnata comparadas às de outras espécies apontou que as funções das proteínas podem ser conservadas na espécie. Em SERK, o Pc contig1 agrupou-se com membros de SERK1 e SERK2, enquanto o Pc contig2 agrupou-se com membros de SERK3/BAK1. Por sua vez, o Pc contig1 de BBM, agrupou-se com membros de BBM1 e BBM2. A expressão do gene SERK foi constatada em embriões zigóticos e gradualmente diminuída até os 20 dias em MI. Aos 30 dias em MI, embriões somáticos globulares foram intensamente marcados, assim como em embriões com 5 e 40 dias em MM. Transcritos do BBM foram observados em embriões zigóticos, no entanto, a expressão foi cessada no decorrer do desenvolvimento dos embriões somáticos. A expressão foi retomada em embriões somáticos cotiledonares após 40 dias em MM, assemelhando-se ao observado no embrião zigótico. Observou-se que em P. setacea, durante o processo embriogênico, houve formação de protuberâncias que deram origem a zonas pró-embriogênicas, as quais se desenvolveram em embriões somáticos. Já em P. cincinnata houve proliferação das células do meristema fundamental e formação de meristemoides, caracterizando regiões organogênicas. Quando transferidos ao meio de maturação não houve regeneração de plantas a partir de embriões somáticos em P. setacea. Em P. cincinnata houve intumescimento das regiões calejadas e, em alguns casos, formação de primórdios foliares. Quanto à expressão gênica, em P. setacea foi constatada expressão de BBM e SERK em todas as fases analisadas, especialmente em protuberâncias e embriões somáticos formados. P. cincinnata, por sua vez, também apresentou transcritos dos genes BBM e SERK em todas as fases analisadas, sendo intensificado o sinal de hibridização na periferia dos explantes e regiões meristemáticas após 20 dias em MI. P. setacea apresentou corpos proteicos com decréscimo gradativo até os 30 dias em meio de indução. Houve presença de carboidratos e amido no explante e seu decréscimo após 10 dias, e verificou-se a síntese de novo de amido aos 30 dias de indução, quando há formação de embriões somáticos. Não foi verificada a presença de corpos lipídicos durante o processo embriogênico. Já em P. cincinnata, constatou-se corpos proteicos e amido de forma moderada em todas as etapas de desenvolvimento e a presença de carboidratos totais e corpos lipídicos foi averiguada nas fases iniciais de indução. Após 20 dias, houve mobilização dessas substâncias de reserva concomitantemente com a formação e desenvolvimento de meristemoides. Deste modo, sugere-se que a expressão desses genes está associada aos processos de aquisição de competência embriogênica e podem servir como marcadores moleculares desse processo. Os resultados do isolamento e expressão dos genes SERK e BBM em P. cincinnata são inéditos e contribuem para o melhor entendimento dos processos que envolvem a embriogênese somática na espécie. Nosso trabalho apresenta dados inéditos da indução de embriões somáticos em P. setacea e como as espécies estudadas apresentam respostas morfogênicas divergentes quando submetidas ao mesmo meio de indução. E ainda, relatamos à expressão dos genes BBM e SERK e a mobilização de compostos de reserva no decorrer dos eventos morfogênicos in vitro em P. setacea e P. cincinnata.

The acquisition of embryogenic competence in somatic cells is intriguing process and requires both molecular-genetic and cytological knowledge to better understand the mechanisms and cellular changes involved. Based on this, the aim of this study was to isolate and characterize the expression of SERK and BBM genes in somatic embryos of Passiflora cincinnata, as well as to evaluate the morphogenic in vitro response of Passiflora setacea and P. cincinnata somatic embryogenesis inducted and monitoring the reserve mobilization and expression of the these genes during embryogenesis. For this, RNA was extracted and cDNA was obtained from embryogenic calli of P. cincinnata after 20 days in induction medium (IM), which was used as template for the coding sequence amplification with degenerate primers of SERK and BBM. Mature zygotic embryos of P. setacea and P. cincinnata were inoculated on MS medium supplemented with 31.06 μM of picloram + 2.22 μM of benzyladenine + 2.27 μM of thidizuron + 500mg L -1 of malt extract + 13.77 μM of spermidine. After 30 days, the cultures were transferred to the maturation medium (MM), composed of MS medium supplemented with 1 % of activated charcoal without growth regulators. Samples with 0, 10, 20 and 30 days were collected for light microscopy, scanning electron microscopy, histochemical analyzes and in situ hybridization, following specific protocols. A RNA probe from P. cincinnata cDNA was generated to figure out the expression of SERK and BBM genes, whereas to P. setacea a heterologous sense and antisense probe of P. cincinnata was used. The phylogenetic relationship of P. cincinnata isolated sequences compared with other species suggests that the functions of the proteins are preserved. In SERK, the Pc contig1 grouped up with SERK1 and SERK2 members, while the Pc contig2 grouped with SERK3/BAK1 members. On the other hand, the BBM Pc contig1 was grouped with BBM1 and BBM2 members. The expression of SERK gene was found in zygotic embryos and gradually decreased until 20 days in the IM. After 30 days in the IM, globular somatic embryos were intensely marked with the hybridization signal, as well as embryos with 5 and 40 days in the MM. BBM transcripts were observed in zygotic embryos, but the expression was stopped during the somatic embryos development. The expression was resumed in somatic globular embryos after 40 days in the MM, similar to that observed in zygotic embryos. In the second chapter, in P. setacea embryogenesis process, it was observed the formation of lumps that originate pro-embryogenic zones, which developed into somatic embryos. In P. cincinnata a proliferation of the ground meristem cells and meristemoids formation occurred, emphasizing organogenic regions. When transferred to MM, there was no plant regeneration from somatic embryos of P. setacea. In P. cincinnata, swelling of callus regions and, in some cases, formation of leaf primordia was observed. Regarding the gene expression, in P. setacea there was BBM and SERK expression in all stages, especially in lumps and somatic embryos. Also P. cincinnata showed transcripts of BBM and SERK genes in all stages, with intensification of the hybridization signal at the explants edges and meristematic regions after 20 days in the IM. Protein bodies were found in P. setacea, decreasing gradually until 30 days in the IM. Carbohydrate and starch levels decreased after 10 days, but there was de novo synthesis of starch at 30 days of induction, coupled with the somatic embryos formation. No lipid bodies during the embryogenic process were verified. In P. cincinnata protein bodies and starch were moderately present in all development stages whereas carbohydrates and lipid bodies were present only at the early stages of induction. After 20 days, these reserve substances were mobilized, along with the meristemoids formation and development. Therefore, it is suggested that the expression of these genes is associated with embryogenic competence acquisition process and can be a molecular marker of this process. These results of isolation and expression of SERK and BBM genes in P. cincinnata are original and contribute to a better understanding of the processes involving somatic embryogenesis in this species. This work brings a new approach for somatic embryogenesis induction in P. setacea and highlights how these two species show different responses when submitted to the IM. In addition, the expression of the genes BBM and SERK as well as the mobilization of reserve compounds during in vitro morphogenic events in P. setacea and P. cincinnata were related.