Isolamento, identificação e caracterização de um vírus ssDNA circular associado a Momordica charantia

Abstract

Vírus que possuem genoma constituído por DNA fita simples (ssDNA) estão amplamente distribuídos na natureza. As constantes descobertas aliadas à grande diversidade genética desses vírus têm ampliado a compreensão sobre a trajetória evolutiva desse grupo. No Brasil, os vírus DNA fita simples circular causam grandes perdas nas culturas de importância agrícola. Um dos fatores que contribuiu fortemente para o desastre econômico é a transmissão de vírus, onde o maior hospedeiro deles são as plantas não cultivadas. Desde então, diversos trabalhos têm sido publicados tratando de assuntos como diversidade, caracterização, determinação da gama de hospedeiros, interações entre planta e patógeno assim como patógeno e vetor, evolução, predominância, epidemiologia, dentre outros. O presente trabalho teve como objetivo isolar, identificar e caracteriza um novo vírus de ssDNA associado a Melão de São Caetano (Momordica charantia), uma cucurbitácea não cultivada e potencialmente invasiva em cultivos agrícolas no Brasil. A amostra foi coletada em Coimbra, MG- Brasil, com suspeita de ter um vírus da família Geminiviridae por apresentar sintomas de mosaico amarelo. O DNA vegetal foi extraído e analisado através da técnica de amplificação por círculo rolante, os produtos da clivagem com enzimas de restrição foram clonados e completamente sequênciados. A análise das sequências indicou que o vírus tinha um tamanho de 2195 pares de bases e uma organização genômica que apresentava três proteínas: uma codificando o capsídeo do vírus (CP) e duas relac ionada com a replicação (Rep) separadas por um íntron, que a ser removido por inspeção manual codifica a proteína completa. Essa organização em conjunto com as análises do genoma completo mostraram uma identidade com vários isolados do gênero Gemycircularvirus, sendo proposto para esse novo vírus o nome de Momordica charantia associated circular DNA virus (MCasCV). Interessantemente, MCasCV tem uma característica única dentro dos novos ssDNA: um nonanucleotídeo (5'- TAATGTTAT-3') similar ao Hypericum japonicum associated circular DNA virus (HJasCV), com uma formação de um grampo ou “stem- loop” atípico pela ligação de três pares de base encontradas na estrutura. Com o objetivo de caracterizar a biologia do vírus MCasCV foram infectadas plantas de M. charantia e o fungo Sclerotinia sclerotiorum. Para isso, plantas foram bombardeadas com partículas do clone infeccioso de MCasCV e se observou após 21 dias que não apresentaram sintomas visíveis. A confirmação da presença viral foi realizada pelas técnicas de RCA e PCR obtendo um resultado negativo. Para inoculação do vírus em Sclerotinia sclerotiorum, foram transfectados protoplastos desse fungo junto ao clone infeccioso, após o crescimento foi realizada uma extração de DNA total, seguida da confirmação por PCR e RCA, que ao igual da planta os resultados foram negativos. Fatos que podem explicar esse resultado é a ocorrência de falhas no processo de transfecção, ou a não capacidade do vírus de replicar no interior do fungo utilizado. Novas análises de infectividade d everão ser realizadas para a confirmação do hospedeiro do vírus MCasCV.

Viruses that have genomes composed of single-stranded DNA (ssDNA) have been widespread in nature. Continuous discoveries combined with the high genetic diversity of these viruses have leaded our understanding of the historical evolution of this group. In Brazil, the circular single-stranded DNA viruses have caused enormous agricultural losses in staple crops. One factor that strongly contributed to the financial disaster is the transmission of the virus, where the most of the hosts are non-cultivated plants. Since then, several studies have been published, addressing issues such as diversity, characterization, determining the host range and inte ractions between plant and pathogen as well as pathogen and vector, evolution, prevalence, epidemiology, among others. This study aimed to isolate, identify and features a new virus ssDNA associated with Melon de São Caetano (Momordica charantia), one cucurbit uncultivated and potentially invasive in agricultural crops in Brazil. The sample was collected in Coimbra, MG, Brazil, suspected of having a virus Geminiviridae family for symptoms of yellow mosaic. The plant DNA was extracted and analyzed by the tec hnique of rolling circle amplification, the products of cleavage with restriction enzymes have been cloned and completely sequenced. Sequence analysis indicated that the virus had a size of 2195 base pairs and a genomic organization that showed three prote ins: one encoding the virus capsid (CP) and two related replication (Rep) separated by an intron, then it was removed by manual inspection to encoding the complete protein. This arrangement in conjunction with the analysis of complete genome showed an identity with several strains of genus Gemycircularvirus, it has been proposed to name this new virus from Momordica charantia associated circular DNA virus (MCasCV). Interestingly, MCasCV has a unique feature within the new ssDNA: A nonanucleotídeo (TAATGTTAT 5'-3 ') similar to the circular DNA Hypericum japonicum associated virus (HJasCV), with a formation of a staple or "stem- loop" atypical for binding three base pairs found in the structure. With the objective of characterizing the biology of the virus MCasCV M. charantia plants were infected and Sclerotinia sclerotiorum. For this, plants were bombarded with particles of the infectious clone MCasCV and were observed during 21 days, after that interval of time no showed visible symptoms. Confirmation of viral presence was made by RCA and PCR getting a negative result. For virus inoculation of Sclerotinia sclerotiorum, this fungus protoplasts were transfected with the infectious clone, after growing a total DNA extraction was performed, followed by PCR and confirmed by RCA, again the results were negative. Facts that can explain this result is the occurrence of failures in the transfection process, or no ability of the virus to replicate inside the fungus used. New analysis of infectivity should be performed to confirm the MCasCV in the virus host.