Clonagem molecular do Tomato chlorotic mottle virus (TCMV) e estudos de pseudo- recombinação entre begomovírus de tomateiros e Sida sp.

Abstract

A família Geminiviridae, caracterizada pela morfologia de partículas icosaédricas geminadas e genoma composto por DNA de fita simples circular, é dividida em quatro gêneros, de acordo com o tipo de inseto vetor, gama de hospedeiros, organização do genoma e relacionamento filogenético. Os begomovírus possuem dois componentes genômicos, são transmitidos por mosca-branca e infectam dicotiledôneas. A partir de 1994 houve relatos sucessivos de begomovírus em tomateiro em diversos estados brasileiros. O sequenciamento parcial do genoma de alguns destes vírus revelou que há uma grande diversidade de espécies, provavelmente como resultado da disseminação de vírus nativos pelo biótipo B da mosca-branca Bemisia tabaci. O objetivo do presente trabalho foi a caracterização molecular de uma nova espécie de begomovírus detectada no município de Igarapé, MG, denominada Tomato chlorotic mottle virus, isolado MG-Ig1 (TCMV-[MG- Ig1]), e o estudo da ocorrência de eventos de pseudo-recombinação entre begomovírus que infetam tomateiro e Sida sp. Para a caracterização molecular, foram sintetizados dois pares de oligonucleotídeos sobrepostos com sítios de restrição que possibilitaram a amplificação do genoma completo (fragmentos de aproximadamente 2.600 nucleotídeos para os componentes A e B) do TCMV-[MG-Ig1]. Para o sequenciamento, o genoma completo foi divido em subclones sobrepostos e as seqüências foram montadas com o auxílio de programas apropriados. A análise comparativa das seqüências confirmou a identidade do TCMV-[MG- Ig1] como uma espécie do gênero Begomovirus. Para os estudos de pseudo-recombinação foram misturados componentes virais clonados em uma cópia e meia do TCMV (isolados BA-Se1 e MG-Be1), Tomato rugose mosaic virus (TRMV), Tomato yellow mottle virus (TYMoV) e Tomato golden mosaic virus (TGMV), provenientes de tomateiro, e Sida yellow mosaic virus (SYMV) e Sida mottle virus (SMoV), provenientes de Sida rhombifolia. A inoculação foi realizada via biobalística em plantas de Nicotiana benthamiana, e o diagnóstico da infecção foi confirmado via PCR, utilizando oligonucleotídeos universais para begomovírus. Foram observados sintomas sistêmicos nas plantas inoculadas com os pseudo- recombinantes recíprocos entre TRMV e TGMV, TCMV-[BA-Se1] e TGMV, além de TRMV-A + TYMoV-B, TRMV-B + TCMV-[MG-Be1]-A, TRMV-B + SYMV-A, TCMV- [BA-Se1]-A + TYMoV-B, TCMV-[BA-Se1]-B + SMoV e TCMV-[BA-Se1]-B + SYMV-A. As infecções foram confirmadas via PCR em todos os casos. Os sintomas observados variaram de acordo com a combinação, desde leve clorose entre as nervuras até mosaico amarelo e encarquilhamento severo das folhas. Não foram observados sintomas sistêmicos nas plantas inoculadas com os pseudo-recombinantes recíprocos entre TRMV e TCMV-[BA- Se1], além de TCMV-[BA-Se1]-B + TCMV-[MG-Be1]-A. Na combinação entre TRMV-B + SMoV-A foram observados sintomas sistêmicos, porém apenas o componente A de SMoV foi detectado via PCR.

The Geminiviridae family, characterized by a particle morphology of twinned, incomplete icosahedra and a single-stranded, circular DNA genome, is divided into four genera according to the type of insect vector, host range, genomic organization and phylogeny. The begomoviruses have two genomic components, are transmitted by whiteflies and infect dicot plants. Since 1994 there have been successive reports of begomovirus infection in tomato, in several states of Brazil. Partial sequencing of the genome of some of the isolates revealed a high degree of genetic diversity, probably due to the dissemination of indigenous viruses by the B biotype of the whitefly Bemisia tabaci. The objective of the present work was the molecular characterization of a new species of begomovirus detected at the city of Igarapé, MG, named Tomato chlorotic mottle virus, isolate MG-Ig1 (TCMV-[MG- Ig1]), and the study of pseudorecombination events among begomoviruses from tomato and Sida sp. for the molecular characterization, two sets of overlapping primers with a common restriction site were designed to amplify the full-length viral genome (approximately 2.600 nucleotide fragments for the DNA-A and DNA-B) of TCMV-[MG-Ig1]. The full-length clones were subcloned for sequencing, and the sequences were assembled using the appropriate computer programs. Comparative analysis confirmed the identity of TCMV-[MG- Ig1] as a species of the genus Begomovirus. For the pseudorecombination studies, cloned DNA components TCMV (isolates BA-Se1 and MG-Be1), Tomato rugose mosaic virus (TRMV), Tomato yellow mottle virus (TYMoV) and Tomato golden mosaic virus (TGMV), from tomato, and Sida yellow mosaic virus (SYMV) and Sida mottle virus (SMoV), from Sida rhombifolia were mixed and inoculated by particle bombardment into Nicotiana benthamiana plants. Viral infection was confirmed by PCR with general begomovirus primers. Sistemic symptoms were oberved in plants inoculated with the reciprocal pseudorcombinants between TRMV and TGMV, TCMV-[BA-Se1] and TGMV, and also with TRMV-A + TYMoV-B, TRMV-B + TCMV-[MG-Be1]-A, TRMV-B + SYMV-A, TCMV- [BA-Se1]-A + TYMoV-B, TCMV-[BA-Se1]-B + SMoV and TCMV-[BA-Se1]-B + SYMV- A. Infections were confirmed by PCR in all cases. The symptoms observed varied with each combination, from a mild internerval chlorosis to yellow mosaic and severe leak crumpling. Sistemic symptoms were not observed in plants inoculated with the reciprocal pseudorecombinants between TRMV and TCMV-[BA-Se1], and also with TCMV-[BA-Se1]- B + TCMV-[MG-Be1]-A. The combination of TRMV-B + SMoV-A yielded sistemic symptoms, but only the SMoV DNA-A was detected by PCR.