Transformação de Pichia pastoris com o gene de β - galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. lactis

Abstract

A região codificadora do gene LAC4, que codifica a β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. lactis, foi isolada do plasmídeo pLAC4-12, por meio da técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores, que amplificam um fragmento de aproximadamente 3.000 pb. Com os objetivos de expressar e secretar a β- galactosidase, este fragmento foi clonado em um vetor de expressão e secreção pPIC9 do sistema de expressão de Pichia pastoris. A região codificadora LAC4 intacta e uma versão truncada foram fundidas em fase com a seqüência sinal de secreção do fator-α, sob controle do promotor AOX1. A hidrólise dos DNAs recombinantes obtidos com as enzimas de restrição apropriadas confirmou a clonagem da região codificadora LAC4 intacta nas orientações anti-senso e senso e da versão truncada no vetor pPIC9. Os clones foram linearizados e usados para transformar células eletrocompetentes de Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ). Colônias recombinantes foram isoladas e as inserções da região codificadora LAC4 intacta e truncada no genoma da levedura foram confirmadas por “PCR” com iniciadores específicos. Colônias recombinantes positivas foram cultivadas em glicerol e a expressão dos genes recombinantes foi induzida com metanol. Amostras foram coletadas periodicamente e o meio extracelular e a massa de células analisados quanto à atividade de β -galactosidase. Nenhum aumento na atividade de β - galactosidase foi observado perante o controle. Espera-se que a transformação de linhagens da levedura Mut - com os clones obtidos possa resultar na produção de uma proteína funcional.

The codins Kluyveromyces region marxianus of var. the lactis β-galactosidase was isolated LAC4 from gene, pLAC4-12, from by polimerase chain reaction (PCR) technique with primers that amplify a fragment of approximately 3.000 bp. Expression and secretion vector to expresse and secrete β-galactosidase, the intact and truncated LAC4 coding regions were fused in phase with the factor-α secretion signal sequence in the Pichia pastoris pPIC9. Appropriate restriction enzyme hydrolates confirmed the insertion of the intact LAC4 coding region in sense and antisense orientations, as well as its truncated version in to the pPIC9 vector. The clones were linearized and used to transform electrocompetent Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ) cells. Recombinant cells were isolated and the insertions of intact and truncated LAC4 coding regions in the yeast genome were confirmed by PCR with specific primers. Positive recombinant colonies were grown in glycerol and the expression of the heterologous genes was induced with methanol. Samples were periodically collected and the extracellular medium and cell mass were analyzed for β-galactosidase activity. No increase in β-galactosidase activity was observed over the control. The transformation of Mut - yeast cell lines with the clones is expectial to result in the production of a functional protein.