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Tipo: Tese
Título: Caracterização de linhagens recombinantes de Penicillium griseoroseum: análise do cariótipo, da expressão dos genes plg 1 e pgg 2 e da produção de pectina liase e poligalacturonase em resposta ao pH do meio
Título(s) alternativo(s): Characterization of recombinant strains of Penicillium griseoroseum: karyotype analysis, expression of plg1 and pgg2 genes and production of pectin lyase and polygacturonase in response to medium pH
Autor(es): Teixeira, Janaina Aparecida
Primeiro Orientador: Araujo, Elza Fernandes de
Primeiro coorientador: Queiroz, Marisa Vieira de
Segundo coorientador: Passos, Flávia Maria Lopes
Primeiro avaliador: Tótola, Marcos Rogério
Segundo avaliador: Castro, Ieso de Miranda
Terceiro avaliador: Silveira, Wendel Batista da
Abstract: Os estudos genéticos e fisiológicos realizados com o isolado Penicillium griseoroseum CCT6421 ressaltam as vantagens para a sua aplicação como hospedeiro para produção de proteínas. A obtenção e análise de linhagens recombinantes de P. griseoroseum com alta produção de pectina liase (PL) e poligalacturonase (PG) evidenciaram o eficiente sistema de secreção desse fungo, indicando a possibilidade de utilização deste como plataforma para produção de proteínas de interesse industrial. Entretanto, pouco é conhecido sobre a organização do genoma de P. griseoroseum e das linhagens recombinantes. Neste trabalho foi estimado o tamanho do genoma de P. griseoroseum entre 29,8 e 31,0 Mb, distribuídos em quatro cromossomos. O gene plg1, que codifica PL, está em cópia única no genoma de P. griseoroseum e foi localizado no cromossomo II (9,22 Mb). A linhagem recombinante T105, que possui cópias adicionais do gene plg1 sob controle do promotor de gpd de Aspergillus nidulans, apresentou integrações nos cromossomos II, III e IV. As linhagens recombinantes T146 e T20 possuem, respectivamente, cópias adicionais do gene pgg2 e dos genes pgg2 e plg1, sob o controle do promotor de gpd de A. nidulans. O gene pgg2 codifica PG em P. griseoroseum. A análise da expressão dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes de P. griseoroseum multi-cópias, mostrou que o aumento do número de cópias dos genes proporciona o aumento da produção enzimática. Uma cópia do gene plg1, sob o controle do promotor constitutivo, proporcionou um aumento de 200 vezes na expressão em relação ao gene endógeno e duas cópias do gene pgg2, também sob o controle do promotor constitutivo, proporcionaram um aumento de 1100 vezes na expressão em relação ao gene endógeno. A produção e secreção de PL e PG pelas linhagens recombinantes T105, T146 e T20 de P. griseoroseum são afetadas pelas condições de cultivo. As linhagens foram cultivadas em meio tamponado MMT (pH 6,8) e em meio não-tamponado MMNT (pH 6,3 3,0), para verificar a expressão dos genes plg1 e pgg2, produção e secreção de PL e PG em diferentes tempos de cultivo. A transcrição dos genes plg1 e pgg2, nas linhagens recombinantes, é constitutiva e não foi detectado variação em ambos os meios. No entanto, a quantidade de proteína total secretada variou em média 7,8 ± 1,1 μg/mL no meio MMT e 3,25 ± 1,50 μg/mL no meio MMNT. A análise por SDS-PAGE das proteínas do sobrenadante da cultura das linhagens possibilitou verificar uma maior quantidade de PL e PG secretada no meio MMT do que no meio MMNT. A secreção de PL e de PG foram afetadas pela variação do pH do meio, apresentando reduções nas atividades de 6,4 e 3,6 vezes, respectivamente, para a atividade detectada em meio MMNT em comparação ao meio MMT. A variação do pH do meio também alterou a morfologia da hifa e do micélio da linhagem recombinante T20, o que pode estar relacionado com a redução da secreção de PL e PG. Os resultados mostram que a maquinaria de transcrição, tradução e secreção de proteínas do fungo P. griseoroseum responde ao aumento do número de cópias de genes no genoma, observando-se as condições de cultivo.
Genetic and physiological studies conducted with the isolate Penicillium griseoroseum CCT6421 emphasize the advantages for it application as a host for protein production. Obtaining and analysis of P. griseoroseum recombinant strains with high production of pectin lyase (PL) and polygalacturonase (PG) highlighted the efficient secretion system found in this fungus, indicating the possibility of its use as a platform for production of proteins of industrial interest. However, little is known about the genome organization of P. griseoroseum and its recombinant strains. In this work, it was estimated that the genome size of P. griseoroseum is between 29.8 and 31.0 Mb, distributed in four chromosomes. The plg1 gene, that codifies PL, is in single copy in genome of P. griseoroseum, and was located on chromosome II (9.22 Mb). The recombinant strain T105, which has additional copies of the plg1 gene under the control of gpd promoter of Aspergillus nidulans, showed integrations in chromosomes II, III and IV. The recombinant lineages T146 and T20 have additional copies of pgg2 gene and pgg2 and plg1 genes, under the control of gpd promoter of A. nidulans, respectively. The gene pgg2 codifies PG in P. griseoroseum. Analysis of plg1 and pgg2 gene expression, in multi-copy recombinant strains of P. griseoroseum, showed that the increase of gene copy numbers provides the increased enzimatic production. One copy of plg1 gene, under the control of constitutive promoter, provided an increase of 200 times in the expression in relation to the endogenous gene and two copies of the gene pgg2, also under the control of constitutive promoter, resulted in an increase in the expression of 1100 times in relation to the endogenous gene. The production and secretion of PL and PG by P. griseoroseum recombinant strains T105, T146 and T20 are affected by growing conditions. The strains were cultivated in buffered medium MMT (pH 6.8) and not buffered medium MMNT (pH 6.3-3.0) to verify the expression of plg1 and pgg2 genes, production and secretion of PL and PG in different periods. The transcription of plg1 and pgg2 genes in recombinant strains is constitutive and variation was not detected in both media. However, the amount of total protein secreted ranged on average 7.8 ± 1.1 μg.mL-1 on MMT and 3.25 ± 1.50 μg.mL-1 on MMNT. The SDS-PAGE of supernatant proteins allowed detecting larger amount of PL and PG in MMT than in MMNT. The secretion of PL and PG were affected by variation of medium pH, presenting reduction of 6.4 and 3.6 times, respectively, on activity detected on MMNT compared to MMT. The medium pH variation also altered the hyphal and mycelium morphologies of recombinant strain T20, what can be related to the reduction of PL and PG secretion. These results show that the transcription, translation and protein secretion machinery of the fungus P. griseoroseum responds to increase of gene copy number in genome observing the cultivation conditions.
Palavras-chave: Penicillium
Expressão gênica
Pectina liase
Poligalacturonase
Secreção
Penicillium
Gene expression
Pectin lyase
Polygacturonase
Secretion
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Genética animal; Genética molecular e de microrganismos; Genética quantitativa; Genética vegetal; Me
Programa: Doutorado em Genética e Melhoramento
Citação: TEIXEIRA, Janaina Aparecida. Characterization of recombinant strains of Penicillium griseoroseum: karyotype analysis, expression of plg1 and pgg2 genes and production of pectin lyase and polygacturonase in response to medium pH. 2011. 97 f. Tese (Doutorado em Genética animal; Genética molecular e de microrganismos; Genética quantitativa; Genética vegetal; Me) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2011.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1334
Data do documento: 23-Mai-2011
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