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Tipo: Tese
Título: Transformação genética de nós cotiledonares de soja visando à co-supressão do gene da lisofosfatidilcolina aciltransferase
Título(s) alternativo(s): Genetic transformation of soybean cotyledonary node seeking the cosuppression of the lysophosphatidycholine acyltransferase
Autor(es): Martins, Polyana Kelly
Primeiro Orientador: Moreira, Maurílio Alves
Primeiro coorientador: Barros, Everaldo Gonçalves de
Segundo coorientador: Otoni, Wagner Campos
Primeiro avaliador: Lima, Andréia Barcelos Passos
Segundo avaliador: Marcelino, Francismar Corrêa
Abstract: A soja (Glycine max L. Merrill) é uma das mais importantes culturas do mundo e a maior do Brasil em área plantada. O Brasil é o segundo maior produtor mundial desta leguminosa atingindo 56,3 milhões de toneladas na safra 2006/2007. (www.conab.gov.br). Assim, modificações usando técnicas de engenharia genética podem facilitar o rápido desenvolvimento de novas variedades com características de interesse agronômico e industrial. Alterações nas proporções relativas dos ácidos graxos na fração óleo podem ser alcançadas por meio do silenciamento gênico de enzimas do tipo aciltransferases, fosfotransferases e dessaturases, envolvidas na biossíntese de ácidos graxos. Os objetivos deste trabalho foram: isolar um fragmento do gene da lisofosfatidilcolina aciltransferase (LPCAT) de soja, construir um cassete de expressão, contendo este fragmento, sob o controle da região promotora do gene da subunidade α da β-conglicinina (promotor semente-específico) e transformar nós cotiledonares de soja com esta construção, visando à co-supressão do gene LPCAT. A análise por RT-PCR mostrou que o gene LPCAT é expresso em todos os estádios de desenvolvimento da semente. O cassete de aproximadamente 800 pb contendo a seqüência do promotor semente-específico e de parte do gene LPCAT foi clonado no vetor binário pCAMBIA 1304, cujo T-DNA apresenta genes para resistência aos antibióticos canamicina, para seleção em bactérias, e Higromicina B para seleção em plantas. A clonagem foi confirmada por meio de PCR, restrição enzimática e seqüenciamento. A construção clonada no vetor pCAMBIA 1304 foi utilizada para a transformação de soja via Agrobacterium tumefaciens e sonicação. Sementes maduras de soja foram desinfetadas e germinadas em meio B5 durante, aproximadamente, 5 dias. A partir de uma semente, dois explantes foram obtidos, primeiramente removendo-se a raiz, em seguida, a maior parte do hipocótilo e finalmente um corte vertical feito para separar os dois cotilédones. Estes explantes foram transformados com suspensão bacteriana mediante sonicação e adição de acetoseringona. Após 3 dias de co-cultivo, os nós-cotiledonares foram transferidos para meio de indução (SIM) sem agente seletivo, durante 14 dias. Em seguida, foi adicionado ao meio SIM 5mg/L de Higromicina B para seleção dos transformantes. Os explantes que sobreviveram a essa seleção foram transferidos para o meio de elongação (SEM), ainda com Higromicina B, e depois para o meio de enraizamento (RM) sem o agente seletivo. Dois meses após inoculação com A. tumefaciens, múltiplos brotos foram produzidos nas regiões nodais resistentes a Higromicina B que estavam em contato direto com o meio. Análises a partir do DNA de folhas de plantas em fase de aclimatação permitiram a detecção de vários eventos de transformação. Dezessete eventos foram confirmados por reações de PCR com primers específicos para seqüências presentes apenas em plantas transformadas.
The soybean (Glycine max L. Merrill) is one of the most important crops of the world and the biggest in Brazil in cultivated area. Brazil is the second largest world producer of these grain legumes, producing 56.3 million tons in the harvest year 2006/2007 (www.conab.gov.br). Modifications using techniques of genetic engineering can facilitate the fast development of new varieties with agronomic and industrial characteristics of interest. Alterations in the relative proportions of the fatty acids may be reached through genetic transformation of plants by gene silencing. Among these enzymes are desaturases, phosphotransferases and acyltransferases, involved in the fatty acids biosynthesis. The objectives of this work were to isolate the fragment of the soybean lysophosphatidycholine acyltransferase gene (LPCAT), to construct an expression cassette containing this fragment driven by the gene promoter of the α subunit of soybean storage protein β - conglycinine (seed-specific promoter) and to transform soybean cotyledonary node with this construction, seeking to the co-suppression of the LPCAT gene. The RT-PCR analysis showed that the LPCAT gene is expressed in all of the stages of seed development. The cassette of approximately 800 pb containing the seed-specific promoter sequence and of part of the gene LPCAT was cloned in the binary vector pCAMBIA 1304, whose T-DNA presents genes for resistance to the antibiotics kanamicina, for selection in bacteria, and Hygromycin B for selection in plants. The cloning was confirmed through PCR, enzymatic restriction and sequencing. The construction cloned in the vector pCAMBIA 1304 was used for soybean transformation by sonication using Agrobacterium tumefaciens. Mature soybean seeds were sterilized and germinated in B5 medium during, approximately, five days. From a single seedling, two explants were obtained, that were removed the root, followed by most of the hypocotyl and finally separated into two cotyledons. These explants were transformed with bacterial suspension by sonication and acetosyringone addition. After three days of co-cultivation, the cotyledonary node were then transferred to shoot induction medium (SIM) without selective agent, for 14 days. Soon afterwards, it was added to the medium SIM 5 mg/L of Hygromycin B for selection of transformed shoots. The selected explants were transferred to a shoot elongation medium (SEM), still with Hygromycin B, and later for the rooting medium (RM) without the selective agent. Two months after inoculation with A. tumefaciens, multiple shoots were produced in the node area resistant to Hygromycin B that were in direct contact with the medium. Leaf DNA analyses from plants in phase of acclimatization allowed the detection of several transformation events. Seventeen transgenic plants were confirmed by PCR analyses with specific primers for sequences present only in transformed plants.
Palavras-chave: Ácidos graxos
Biossíntese
Transformação genética vegetal
Agrobacterium tumefaciens
Fatty acids
Biosynthesis
Genetic transformation of plants
Agrobacterium tumefaciens
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Genética animal; Genética molecular e de microrganismos; Genética quantitativa; Genética vegetal; Me
Programa: Doutorado em Genética e Melhoramento
Citação: MARTINS, Polyana Kelly. Genetic transformation of soybean cotyledonary node seeking the cosuppression of the lysophosphatidycholine acyltransferase. 2007. 94 f. Tese (Doutorado em Genética animal; Genética molecular e de microrganismos; Genética quantitativa; Genética vegetal; Me) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2007.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1417
Data do documento: 2-Abr-2007
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