Expressão do peptídeo vacina SBm7462® anti-carrapato Rhipicephalus microplus em plantas transgênicas (Arabidopsis thaliana)

Abstract

A demanda por vacinas parasitárias em saúde animal é crescente. Os prejuízos causados pela infestação de carrapatos e as doenças transmitidas pelos mesmos estão na ordem de bilhões de dólares, sendo o carrapato Rhipicephalus microplus o parasito de maior impacto econômico na pecuária do Brasil e dos países com clima tropical e subtropical. Pesquisas de ponta, aplicando ferramentas de biotecnologia, são usadas em alguns ou em todos os estágios no desenvolvimento de vacinas. A produção de proteínas heterólogas é uma promissora alternativa para a fabricação de vacinas. Os vegetais representam um dos sistemas mais econômicos para a produção em larga escala de proteínas para uso industrial e farmacêutico, o que significa utilizar as plantas como biofábricas. O objetivo do presente trabalho é produzir antígenos vacinais homólogos do peptídeo sintético SBm7462® contra o carrapato R. microplus, em plantas (Arabidopsis thaliana) transformadas com gene sintético. O gene denominado seq2, que possui a seqüência da SBm7462® repetida três vezes em tandem foi inserido em vetores de doação (pDONR201) e, em seguida, em vetores de expressão binário para plantas (pk7WG2 e o pk7FWG2), utilizando-se o sistema Gateway®. Pela seleção em meio com antibiótico e reação em cadeia de polimerase (PCR), selecionaram-se as plantas transformadas positivamente, a presença do transgene nessas foi confirmado por sequenciamento genético. As plantas transgênicas com melhor desenvolvimentoapresentaram o gene seq2 integrado ao seu genoma. Para avaliar a expressão do peptídeo recombinante foram realizadas as técnicas de RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction), imunohistoquímica e análise em microscópio confocal. As proteínas recombinantes denominadas rBm7462 foram expressas no apoplasto das células epidérmicas das folhas transgênicas. As plantas com os maiores níveis de expressão foram selecionadas para, nas próximas gerações, imunizar camundongos BALB/c. Esse é o primeiro estudo da produção de subunidades vacinais em plantas transgênicas contra um ectoparasito.

The demand for parasitic vaccines in animal health is growing. The damage due to infestation of ticks and diseases transmitted by them are in the billions of dollars, and the tick Rhipicephalus microplus parasite of the greater economic impact on livestock in Brazil and in countries with tropical and subtropical climates. Advanced research projects, applying tools of biotechnology are used in some or all stages in the development of vaccines. The production of heterologous proteins is a promising alternative for the manufacture of vaccines. The plants represent one of the most economical for large-scale production of proteins for industrial and pharmaceutical, which means using plants as biofactories. The objective of this work is to produce vaccine antigens homologous synthetic peptide SBm7462® against the tick R. microplus in plants (Arabidopsis thaliana) transformed with synthetic gene. The gene seq2, which has the sequence SBm7462® repeated three times in tandem was inserted into donor vector (pDONR201) and then in binary expression vectors for plants (pk7WG2 and pk7FWG2), using the Gateway® system. By selection in medium with antibiotics and polymerase chain reaction (PCR) were selected as positively transformed plants, the presence of these transgene was confirmed by genetic sequencing. Transgenic plants with improved development presented seq2 gene integrated in its genome. To evaluate the expression of the recombinant peptide were carried out RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction), immunohisto chemistry and confocal microscope analysis. The recombinant proteins were expressed rBm7462 the apoplast of epidermal cells of transgenic leaves. Plants with the highest levels of expression were selected for new generations, to immunize BALB/c. This is the first study of the production of subunit vaccine in transgenic plants against an ectoparasite.