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Tipo: Tese
Título: Efeito da adição de um quelante de cálcio sobre a qualidade do sêmen descongelado de cães
Título(s) alternativo(s): Effects of a calcium quelant agent in the quality of frozen-thawed dog sperm
Autor(es): Souza, Thyara de Deco
Primeiro Orientador: Paula, Tarcízio Antônio Rego de
Primeiro avaliador: Guimarães, José Domingos
Segundo avaliador: Costa, Eduardo Paulino da
Terceiro avaliador: Csermak Junior, Antonio Carlos
Quarto avaliador: Peixoto, Juliano Vogas
Abstract: Objetivou-se por meio deste trabalho avaliar o efeito da redução da quantidade de cálcio livre no meio de congelamento, utilizando o quelante de cálcio EDTA nas concentrações de 0,3% e 0,5%, sobre a qualidade do sêmen descongelado de cães. O ejaculado de três cães sem raça definida foi coletado por manipulação peniana e avaliado quanto ao vigor, motilidade espermática, morfologia espermática e pelo teste hiposmótico (HOST). Posteriormente, o sêmen foi separado em três alíquotas, as quais foram diluídas respectivamente no meio controle (TGE), de forma a se obter uma concentração final de 50 x 106 espermatozoides móveis/mL, 6% de glicerol e 0,5% de Equex STM Paste® em meio Tris-Citrato com gema de ovo (20% V/V); no meio de congelamento EDTA 0,3, com a mesma constituição do TGE, porém acrescido de EDTA para uma concentração final de 0,3%; e no meio de congelamento EDTA 0,5 em que o EDTA foi acrescido para uma concentração final de 0,5%. Após envasado em palhetas de 0,25mL o sêmen de cada tratamento foi resfriado por duas horas e congeladas em vapor de nitrogênio por 15 minutos. As amostras foram descongeladas por imersão em água a 37oC, durante sete segundos e avaliadas da mesma forma que o sêmen fresco e pelos testes de termorresistência, de ligação à membrana perivitelina de ovo de galinha (MPOG) e quanto à integridade das membranas plasmática e do acrossoma por coloração com sondas fluorescentes. A concentração do cálcio foi dosada, em espectrofotômetro, no sêmen fresco diluído no meio TGE e depois de descongelado. Houve redução (Duncan a 5% de significância; p<0,05) na concentração de cálcio em ambos os tratamentos EDTA 0,3 e EDTA 0,5, porém somente quando EDTA foi adicionado para a concentração final de 0,5% foi possível indisponibilizar todo o cálcio livre presente no meio. De acordo com a coloração por sondas fluorescentes a redução ou a eliminação do cálcio livre no meio não foi capaz de reduzir a quantidade de espermatozoides descongelados com acrossoma lesado/reagido (p>0,05) em relação ao grupo TGE, com 10,8% a 14% de espermatozoides apresentando ambas as membranas íntegras. No teste hiposmótico, não houve diferença (p>0,05) na quantidade de espermatozoides com integridade funcional da membrana nos tratamentos EDTA 0,3 e EDTA 0,5 em relação ao grupo TGE. Não houve diferença na quantidade de espermatozoides aderidos à MPOG e na longevidade espermática (TTR) entre o grupo TGE e os tratamentos EDTA 0,3 e EDTA 0,5. Não houve diferença (p>0,05) na motilidade espermática entre o grupo TGE (74,70%) e o tratamento EDTA 0,3 (62,78%) porém, houve redução (p<0,05) para este parâmetro no tratamento EDTA 0,5 (45%), enfatizando a importância do cálcio para a motilidade espermática. A redução ou eliminação do cálcio no meio de congelamento, portanto não foi capaz de reduzir a ocorrência de criocapacitação e reação acrossomal prematura, o que melhoraria a qualidade espermática após o descongelamento. Desta forma, há outros fatores presentes no meio e/ou no processamento usado para a criopreservação que estão provocando lesão e favorecendo a ocorrência da capacitação e RA prematuras nos espermatozoides.
We aim to evaluate the effect of reducing the free calcium in the freezing medium, using a calcium chelating agent (EDTA) at concentrations of 0.3% and 0.5%, on the quality of frozen-thawed dog sperm. The sperm-rich fractions from three mixed breed dogs was collected by penile stimulation and evaluated for sperm progressive status, sperm motility, sperm morphology and hypoosmotic swelling test (HOST). Thereafter, it was divided into three aliquots, which were diluted in a Tris-based extender to reach a final concentration of 50 x 106 motile spermatozoa / mL, 6% glycerol and 0.5% Equex STM Paste® (TGE), or in the same extender with the addition of EDTA to a final concentration of 0.3% (EDTA0.3) or to a final concentration of 0.5% (EDTA0.5). After packaged in 0.25 ml straws each treatment was cooled for two hours and frozen in nitrogen vapor for 15 minutes. The samples were thawed by immersion in water bath at 37 °C for 7 seconds and evaluated as the fresh semen and for the thermoresistance test, the sperm- (MPOG) binding assay and for the integrity of the sperm plasma and acrosome membrane, using fluorescent probes. The calcium concentration as measured, using a spectrophotometer, in diluted fresh semen and in frozen-thawed semen. There was reduction (Duncan at 5% of significance; p <0.05) in calcium concentration in both treatments EDTA0.3 and EDTA0.5 but only when EDTA was added to a final concentration of 0.5% all the free calcium present in the medium was removed. According to the fluorescent probes the reduction or the elimination of free calcium in the medium was not able to reduce the amount of frozen-thawed sperm with damaged / reacted acrosome (p> 0.05) compared to group TGE, with 10.8 % to 14% of sperm showing both membranes intact. There was also no difference in the number of spermatozoa bound to MOPG in the group TGE and EDTA0.3 and EDTA0.5 treatments. Although there was no difference (p> 0.05) in sperm motility between the TGE group (74.70%) and EDTA0.3 (62.78%) treated group, this parameter decreased (p <0.05) in EDTA0.5 treatment (45%), emphasizing the importance of calcium for sperm motility. Therefore the reduction or elimination of free calcium in the freezing medium able to reduce the premature cryocapacitaion and acrosome reaction, which would improve sperm quality after thawing. Thus there are other factors in the medium and / or processing used that are triggering injury and favoring the incidence of premature capacitation and AR in sperm.
Palavras-chave: EDTA
Capacitação
Criopreservação espermática
EDTA
Capacitation
Sperm cryopreservation
CNPq: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::MEDICINA VETERINARIA
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Biotecnologia, diagnóstico e controle de doenças; Epidemiologia e controle de qualidade de prod. de
Programa: Doutorado em Medicina Veterinária
Citação: SOUZA, Thyara de Deco. Effects of a calcium quelant agent in the quality of frozen-thawed dog sperm. 2013. 55 f. Tese (Doutorado em Biotecnologia, diagnóstico e controle de doenças; Epidemiologia e controle de qualidade de prod. de) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2013.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1462
Data do documento: 26-Jul-2013
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