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Tipo: Tese
Título: Influência do metabolismo de carbono e do nível de oxigênio sobre a localização da permease de lactose em Kluyveromyces lactis
Título(s) alternativo(s): Influence of carbon metabolism and oxygen level on lactose permease localization in Kluyveromyces lactis
Autor(es): Silveira, Wendel Batista da
Primeiro Orientador: Passos, Flávia Maria Lopes
Primeiro coorientador: Queiroz, Marisa Vieira de
Segundo coorientador: Mantovani, Hilário Cuquetto
Primeiro avaliador: Costa, Maurício Dutra
Segundo avaliador: Fietto, Luciano Gomes
Terceiro avaliador: Araújo, Pedro Soares de
Abstract: Neste trabalho foi analisada a influência da fonte de carbono e do nível de oxigênio sobre a localização da permease Lac12GFPp na levedura Kluyveromyces lactis. Inicialmente, foi mostrado que K. lactis apresenta afinidade maior para lactose do que para glicose. Os dados indicaram que a localização da permease Lac12GFPp dependente da KlSnf1p não foi afetada pela presença de glicose. A localização dessa permease foi similar quando K. lactis foi cultivada em galactose e glicose, mas diferente quando cultivada em lactose. Os níveis de mRNA do gene LAC12GFP expressos a partir do promotor ADH1, que não está sob a influência da KlSnf1p, foram similares entre a linhagem selvagem e o mutante Klsnf1. Esse resultado mostra que a influência da KlSnf1p sobre a expressão do gene LAC12GFP é exercida marcantemente somente em nível pós-traducional. A análise da localização subcelular da permease de lactose no mutante Klsnf1 evidenciou que a permease é encontrada na membrana do vacúolo, sugerindo que Klsnf1p pode estar envolvida com a translocação da permease para dentro do vacúolo. Em condições hipóxicas, até 3 h de crescimento, foi observado aumento do sinal da permease de lactose na membrana plasmática, em compação com as condições normóxicas. Na tentativa de isolar reguladores negativos do transporte de lactose em K. lactis, realizou-se uma triagem genética (supressão multicópia). A supressão multicópia foi utilizada para selecionar transformantes capazes de suprimir a toxicidade da lactose observada no mutante Kllac4 cultivado em meio mínimo contendo lactose e glicerol como fontes de carbono. Entre os 68 plasmídeos recuperados do mutante Kllac4 transformado com uma biblioteca genômica, nove apresentaram tamanho maior que o do vetor vazio (Kep6). Contudo, os dados deste estudo indicam que a supressão foi devida a uma mutação espontânea. Nesses mutantes, o transporte de lactose não foi prejudicado.
In this work we analyzed the influence of the carbon source, oxygen level and snf1 mutation on the subcelular localization of Lac12GFP permease in the yeast Kluyveromyces lactis. Initially we showed that K. lactis has higher affinity for lactose than for glucose. Our data suggest that the KlSnf1p dependent subcelular localization of Lac12GFP permease was not affected by glucose. Furthermore, we observed that the subcelular localization of this permease was similar when K. lactis was grown on galactose and glucose, but different on lactose. The mRNA levels of the LAC12GFP gene expressed from KlSnf1p independent promoter were similar between the wild type and Klsnf1 mutant, indicating that KlSnf1p markedly affects the LAC12GFP gene expression only at post- translational level. Analysis of the subcelular localization of lactose permease in Klsnf1 mutant showed that the permease is found intracellularly at the vacuole membrane, suggesting that Klsnf1p may be involved with the lactose permase translocation into vacuole. In hypoxic condition, more lactose permease was localized at plasma membrane up to 3 hours of growth, indicating that the oxygen availability influences the localization of Lac12GFPp. Furthermore, we performed a screening (multicopy suppression) to identify negative regulators of lactose uptake in K. lactis. The multicopy suppression was used to select transformants able to suppress lactose toxicity, because lactose is toxic for Kllac4 mutant grown on minimal medium containing lactose plus glycerol as a carbon source. Among the 68 plasmids rescued from WBS1 (lac4 mutant) transformed with a Kep6-based genomic plasmid library (multicopy suppression), nine were bigger than Kep6 (empty vector). Nevertheless, our data showed that the suppression was due to a spontaneous mutation. In these mutants the lactose uptake was not impaired.
Palavras-chave: Kluyveromyces lactis
Permease de lactose
Metabolismo
Oxigênio
Kluyveromyces lactis
Lactose permease
Metabolism
Oxigen
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::MICROBIOLOGIA::BIOLOGIA E FISIOLOGIA DOS MICROORGANISMOS
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse
Programa: Doutorado em Microbiologia Agrícola
Citação: SILVEIRA, Wendel Batista da. Influence of carbon metabolism and oxygen level on lactose permease localization in Kluyveromyces lactis. 2007. 101 f. Tese (Doutorado em Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2007.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1527
Data do documento: 28-Set-2007
Aparece nas coleções:Microbiologia Agrícola

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