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dc.contributor.authorPonce, Adriana dos Reis
dc.date.accessioned2015-03-26T12:50:58Z-
dc.date.available2014-08-29
dc.date.available2015-03-26T12:50:58Z-
dc.date.issued2011-11-28
dc.identifier.citationPONCE, Adriana dos Reis. Phenotypics characteristics controlled for quorum sensing in Aeromonas hydrophila.. 2011. 110 f. Tese (Doutorado em Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2011.por
dc.identifier.urihttp://locus.ufv.br/handle/123456789/1557-
dc.description.abstractAs bactérias apresentam um sistema elaborado de comunicação entre células dependente de densidade celular, denominado quorum sensing. O conhecimento de fenótipos controlados por esse sistema, como a produção de enzimas hidrolíticas que resultam na deterioração de alimentos, formação de biofilmes e mecanismos de patogenicidade podem contribuir para a elucidação de processos importantes na microbiologia de alimentos e permitir a elaboração de estratégias de controle de patógenos e deterioradores. O objetivo deste trabalho foi determinar fenótipos regulados por quorum sensing em Aeromonas hydrophila, isolada de leite cru refrigerado. Foram comparadas características fenotípicas, como produção de enzimas hidrolíticas, motilidade, formação de biofilmes e perfil protéico das estirpes selvagens Embrapa 029 e ATCC 7966 de A. hydrophila mutantes incapazes de sintetizar homoserina lactonas aciladas (AHLs), moléculas sinal do sistema quorum sensing. Os mutantes de A. hydrophila foram construídos utilizando a estratégia de mutação sítio dirigida, pela interrupção do gene ahyI com o gene que codifica gentamicina-3-acetiltransferase, utilizando o vetor suicida pKNG101. Os mutantes 029-8, 029-14 e 029-21, comprovadamente apresentaram o sistema quorum sensing comprometido e não foram capazes de produzir AHL detectáveis pelo biomonitor Chromobacterium violaceum CV026. Entretanto, estes mutantes apresentaram os genes ahyI e ahyR intactos quando analisados por PCR. Pela técnica de RT-PCR foi constatado que A. hydrophila QS 029-14 foi incapaz de transcrever os genes ahyR e ahyI, o que comprovou a incapacidade de produzir a proteína reguladora de resposta (AhyR) e a sintase de AHL (AhyI). Estes mutantes perderam a capacidade de hidrolisar gelatina e apresentaram perda ou redução da atividade de hidrólise de caseína. A atividade de β-hemólise e a motilidade tipo swimming, comumente observada na estirpe selvagem, não foram observadas no mutante A. hydrophila QS 029-14, o que indica que estas características estão sob regulação do quorum sensing. As estirpes selvagens e mutantes apresentaram atividades das enzimas amilase e lipases. Estirpes selvagens e o mutante QS 029-14 de A. hydrophila foram capazes de aderir aos cupons de aço inoxidável imersos em meio TYEP. Entretanto, menor adesão do mutante QS 029-14 foi verificada tanto pela contagem de células sésseis viáveis como pela observação microscópica dos cupons. Este resultado reforça as evidências do envolvimento do mecanismo de quorum sensing na regulação da formação de biofilmes nesta espécie. A análise dos sobrenadantes livres de células e de proteínas intracelulares, em gel de poliacrilamida 12 %, evidenciou a expressão diferencial de proteínas extracelulares e intracelulares produzidas pelas estirpes A. hydrophila Embrapa 029, ATCC 7966 e A. hydrophila mutante QS 029-14, sugerindo que o sistema quorum sensing pode estar envolvido na regulação de algumas proteínas extracelulares e intracelulares. A análise de espectrometria de massa e sequenciamento da região amino-terminal de uma banda de proteína presente no sobrenadante extracelular da estirpe mutante QS 029-14 sugerem uma maior expressão de transportador ABC nesta estirpe. Os resultados sugerem que o sistema quorum sensing ou o fator ou fatores que regulam a transcrição dos genes ahyI e ahyR regulam a expressão de genes responsáveis pela atividade proteolítica, β-hemólise, motilidade, formação de biofilmes e possivelmente de transportadores de membrana em A. hydrophila.pt_BR
dc.description.abstractBacteria have a communication system among cells, dependent on cellular density, called quorum sensing. Knowledge of phenotypes controlled by this system, such as production of hydrolytic enzymes which result in food spoilage, biofilm formation and mechanisms of pathogenicity will contribute to elucidate important processes in food microbiology and development of control strategies for pathogenic and spoilage microorganisms. The aim of this study was to determine the phenotypes regulated by quorum sensing in Aeromonas hydrophila isolated from cooled raw milk. Phenotypic characteristics, such as production of the hydrolytic enzymes, motility, biofilm formation and protein profile of A. hydrophila ATCC 7966 and Embrapa 029 wild-type strains, and acyl homoserine lactones (AHLs)-deficient mutant were compared. A. hydrophila QS mutants were constructed using a site-directed mutagenesis strategy. The ahyI gene was interrupted by gentamicin 3-acetyltransferase gene using the suicide vector pKNG101. Mutant bacteria 029-8, 029-14 and 029-21 showed the quorum sensing system compromised and they were not able to produce detectable AHL by the Chromobacterium violaceum CV026. However, A. hydrophila mutants showed intact ahyI and ahyR when analyzed by PCR. By RT-PCR technique, A. hydrophila mutant strain QS 029-14 was unable to transcribe ahyI and ahyR genes, which proved the inability to produce the regulatory protein response (AhyR) and AHL synthase (AhyI). These mutants lost the capacity to hydrolyze gelatin and showed losses or reduction of proteolytic activity. Swimming motility and β-hemolysis activity were observed in wild-type strain while these characteristics were absent in A. hydrophila QS 029-14. This leads to the indication that these features are under regulation of quorum sensing system. Both wild-type and mutant strains showed amylase and lipase activities. A. hydrophila wild-type and its mutant strain QS 029-14 were able to adhere on stainless steel coupons immersed in TYEP broth. The mutant strain QS 029-14 showed a lower adhesion which was verified by both the viable sessile cells counts and microscopic analysis of the coupons. This result strongly indicates the role of quorum sensing mechanism in the regulation of biofilm formation in this species. Polyacrylamide gel analysis of cell-free supernatants and intracellular proteins showed a differential expression of intracellular and extracellular proteins produced by A. hydrophila ATCC 7966 and Embrapa 029 wild-type strains and A. hydrophila 029-14 mutant strain. These data leads to the indication that quorum sensing system might be involved in the regulation of some extracellular and intracellular proteins. The mass spectrometry analysis and sequencing of the amino-terminal region of the protein band present in the extracellular supernatant of the mutant strain QS 029-14 suggest an increased expression of ABC-type transporter. These results suggest that the quorum sensing system or the factor or factors related to the transcription of genes ahyI and ahyR regulate the expression of genes responsible for the proteolytic activity, β-hemolysis, motility and biofilm formation in A. hydrophila.eng
dc.description.sponsorshipConselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
dc.formatapplication/pdfpor
dc.languageporpor
dc.publisherUniversidade Federal de Viçosapor
dc.rightsAcesso Abertopor
dc.subjectComunicação celularpor
dc.subjectMutante AHLpor
dc.subjectAlterações fenotípicaspor
dc.subjectProteasespor
dc.subjectBiofilme bacterianopor
dc.subjectCell communicationeng
dc.subjectMutant AHLeng
dc.subjectphenotypic changeseng
dc.subjectProteases, Bacterial biofilmeng
dc.titleCaracterísticas fenotípicas reguladas por quorum sensing em Aeromonas hydrophilapor
dc.title.alternativePhenotypics characteristics controlled for quorum sensing in Aeromonas hydrophila.eng
dc.typeTesepor
dc.contributor.authorLatteshttp://lattes.cnpq.br/1564233636924536por
dc.contributor.advisor-co1Ribon, Andréa de Oliveira Barros
dc.contributor.advisor-co1Latteshttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026E6por
dc.contributor.advisor-co2Araujo, Elza Fernandes de
dc.contributor.advisor-co2Latteshttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783675E2por
dc.publisher.countryBRpor
dc.publisher.departmentAssociações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interessepor
dc.publisher.programDoutorado em Microbiologia Agrícolapor
dc.publisher.initialsUFVpor
dc.subject.cnpqCNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::CIENCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS::CIENCIA DE ALIMENTOSpor
dc.contributor.advisor1Vanetti, Maria Cristina Dantas
dc.contributor.advisor1Latteshttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4783874H3por
dc.contributor.referee1Bazzolli, Denise Mara Soares
dc.contributor.referee1Latteshttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4761710D6por
dc.contributor.referee2Oliveira, Leandro Licursi de
dc.contributor.referee2Latteshttp://lattes.cnpq.br/0578231392218162por
dc.contributor.referee3Pinto, Uelinton Manoel
dc.contributor.referee3Latteshttp://lattes.cnpq.br/4416935405600300por
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