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Tipo: Tese
Título: Isolamento e caracterização dos genes que codificam malato sintase e o repressor Nrg1 em Crinipellis perniciosa, agente causal da vassoura-de-bruxa no cacaueiro (Theobroma cacao)
Título(s) alternativo(s): Isolation and characterization of the genes coding for either the malate sintase and the Nrg1 repressor in Crinipellis perniciosa, an agent responsible for he witches broom on cocoa plant (Theobroma cacao)
Autor(es): Medina, Pilar Ximena Lizarazo
Primeiro Orientador: Queiroz, Marisa Vieira de
Primeiro coorientador: Araujo, Elza Fernandes de
Segundo coorientador: Mantovani, Hilário Cuquetto
Primeiro avaliador: Cordeiro, Vanessa Kava
Segundo avaliador: Moraes, Célia Alencar de
Abstract: Os genes que codificam o repressor catabólico Nrg1 e a enzima malato sintase de Crinipellis perniciosa foram clonados e caracterizados. A região codificadora do gene nrg1 possui 2121 pb e é interrompida por um íntron de 60 pb posicionado a partir da análise da seqüência de cDNA. Análises por hibridização do DNA total mostraram que o gene está presente em cópia única no genoma do fungo. A proteína deduzida apresenta dois dedos de zinco característicos de proteínas Nrg e possui 256 aminoácidos. A região 5 terminal foi seqüenciada e um potencial cis-elemento para a ligação da proteína reguladora PACC foi identificado. Foram também detectados os cis-elementos TATA box e CAAT box. A regulação da transcrição foi avaliada pela técnica de RT-PCR. O gene foi diferencialmente regulado de acordo com a concentração de glicose. A transcrição de nrg1 foi 2,1 vezes maior no micélio crescido em meio contendo glicose 0,1% do que no meio com glicose 3,0%. Em outra fonte de carbono como glicerol a transcrição foi 4,6 vezes maior do que à reportada em glicose 3,0%. A avaliação da transcrição em relação ao pH indicou uma maior transcrição em pH baixo (pH 2 e 3) do que em pH 4, 6,8 e 8. Esses resultados podem ser explicados pela presença de sítios para a proteína reguladora PacC, que é responsável pela regulação em resposta ao pH. Este é o primeiro relato da presença da proteína repressora Nrg1 em fungos filamentosos. O segundo gene estudado neste trabalho codifica a enzima malato sintase em C. perniciosa. O gene possui 1888 pb e é interrompido por cinco íntrons. Uma proteína de 539 resíduos de aminoácidos foi obtida da tradução deste gene e apresenta a seqüência característica [KR]-[DENQ]-HX(2)-G-L-N-X-W-D-Y-[LIVM]-F. Na região 5 terminal do gene malato sintase foi localizado um possível TATA box e dois possíveis sítios CAAT. A hibridização do DNA de isolados de C. perniciosa dos grupos C1, C2, C3 e C9, com o gene malato sintase, mostrou que este está presente em cópia única no genoma. Interessantemente, esta hibridização permitiu separar os isolados em dois grupos. Nos isolados C1 e C3, que foram coletados na Bahia e no Amazonas, o fragmento hibridizado possui aproximadamente 5.0 kb, mas nos isolados C2 e C9, que foram provenientes da Bahia e do Pará, corresponde a um fragmento de 4,5 kb. A transcrição do gene malato sintase foi analisada pela técnica RTPCR. A transcrição do gene foi analisada após o crescimento do micélio durante 8 dias a 27 ºC, depois este foi lavado e transferido para meio mínimo contendo acetato, isocitrato, glioxilato na presença e ausência de glicose, onde permaneceu 12 ou 24 horas. Foi observada ausência de repressão catabólica. Neste estudo também foi evidenciada a transcrição do gene malato sintase em glicerol e em extrato de polpa de cacau. O isolamento e caracterização dos genes que codificam a malato sintase e a proteína reguladora Nrg1 em C. perniciosa, junto com a disponibilidade de um sistema de transformação, permitiram a obtenção de mutantes para evidenciar os papeis das proteínas na patogenicidade.
The genes codifying for either the catabolic repressor Nrg1 and malate synthase enzyme from Crinipellis perniciosa were cloned and characterized. The codifying? coding? region of the nrg1 gene has 2121 pb and is interrupted by a 60 pb intron as indicated by cDNA sequence analysis. Total DNA blot analyses revealed the gene to be as a single copy in the genome of C. perniciosa. The deduced protein shows two characteristic zinc fingers that are characteristic for Nrg proteins, and has 256 amino acids. The terminal 5 region was sequenced, whereas a putative cis-element for binding the PacC repressor was identified. The cis-elements TATA box and CAAT box were also identified. The transcription of nrg1 was investigated, by applying the RT-PCR technique. The gene was differently regulated according to glucose concentration. The nrg1 transcription was 2.1-fold greater in the mycelia grown in a medium containing 0,1.% glucose than in medium with 3.0% glucose. In other carbon source such as glycerol, the gene was transcripted 4.6-fold greater than in 3.0% glucose. The evaluation of the gene transcription relative to pH pointed out a higher expression at low pH (2 and 3) than at pH values 4, 6.8, and 8. Those results are explained by the presence of the sites for the regulating protein PacC, which is responsible for regulation in response to pH. This is the first report about the presence of this repressor protein Nrg1 in filamentous fungi. The second gene under study codes for the malate synthase enzyme from C. perniciosa. The gene has 1888 pb and is interrupted by five introns. A protein with 539 amino acid residues was obtained from the translation of this gene and exhibits the characteristic sequence [KR]-[DENQ]-H-X(2)-G-L-N-X-WD-Y-[LIVM]-F. A possible TATA box and two possible CAAT sites were located on the 5 flanking region of the malate synthase gene. The DNA hybridization of isolates from C. perniciosa of the groups C1, C2, C3 and C9 with the malate synthase gene showed this one to be present in a single in genome. It is interesting that this hybridization allowed for separating the isolates into two groups. In isolates C1 and C3 collected in Bahia and Amazonas states, the hybridized fragment has 5.0 kb approximately, but the isolates C2 and C9 proceeding from Bahia and Pará states this fragment has 4.5 kb. The transcription of the malate synthase gene was analyzed, by using the technique RT-PCR. This transcription was analyzed and the mycelia grown at 27 ºC for 8 days were used. Then, the mycelia were washed and transferred to a medium containing acetate, isocitrate, glyoxylate in both presence and absence of glucose, where they were kept for 12 or 24 hours. There was observed the absence of the catabolic repression. Also, the transcription of the malate synthase gene was observed in glycerol and in the cocoa pulp extract. The isolation and characterization of the genes codifying the malate synthase and the regulating protein Nrg1 in C. perniciosa together with the availability of the transformation system made possible the obtainment of mutants to evidence the paper of the proteins in pathogenicity.
Palavras-chave: Repressão catabólica
Malato sintase
Crinipellis perniciosa
Catabolic repressor
Malate sintase
Crinipellis perniciosa
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::GENETICA::GENETICA MOLECULAR E DE MICROORGANISMOS
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse
Programa: Doutorado em Microbiologia Agrícola
Citação: MEDINA, Pilar Ximena Lizarazo. Isolation and characterization of the genes coding for either the malate sintase and the Nrg1 repressor in Crinipellis perniciosa, an agent responsible for he witches broom on cocoa plant (Theobroma cacao). 2006. 5 f. Tese (Doutorado em Associações micorrízicas; Bactérias láticas e probióticos; Biologia molecular de fungos de interesse) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2006.
Tipo de Acesso: Acesso Embargado
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/1565
Data do documento: 28-Jul-2006
Aparece nas coleções:Microbiologia Agrícola

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