Isolamento, caracterização e seleção de bactérias diazotróficas em tomateiro

Abstract

As bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCP) e dentro deste grupo as diazotróficas, têm sido testadas para diversas culturas, tendo diferentes resultados frente à sua influência no crescimento e desenvolvimento das plantas, os resultados podem ser positivos, negativos ou não ter resposta com significância estatística. Dentro dos efeitos mais procurados estão a influência destas no fornecimento de nutrientes. O tomateiro é uma cultura amplamente plantada no Brasil e no mundo, seu consumo faz parte da dieta diária da maioria da população e para sua produção é necessário elevado aporte de fertilizantes. A produção de mudas é uma etapa importante do cultivo de tomate e hipotetiza-se que as BPCP possam auxiliar no crescimento e nutrição dos tomateiros. Este trabalho objetivou isolar, caracterizar e selecionar bactérias promotoras de crescimento de plantas que tenham sinergia como a cultura do tomateiro. Os trabalhos foram conduzidos na Universidade Federal de Viçosa, Campus Florestal. Para o isolamento das bactérias amostras de 10g de cada órgão da planta (raiz, caule, folha) foram coletadas de tomateiro, trituradas em 90 mL de solução salina e realizado diluição seriada de 10 -2 a 10 -6 . De cada uma das diluições, alíquotas de 100 μL foram colocadas em triplicata em frascos de penicilina de vidro contendo os meios semissólidos isentos de nitrogênio: NFb, JNFb, JMV, JVMM, JMVL, LGI e LGIP, NFbM e LGIM. A quantificação das bactérias presentes nos meios de cultivo foi realizada pela técnica do número mais provável (NMP). As colônias resultantes foram caracterizadas de acordo com a morfologia das células (forma e coloração de Gram) e as características das colônias (forma, cor, tamanho, elevação, bordo, superfície, mucosidade). Para identificação do caráter solubilizador de fosfato, os isolados cresceram em meio de cultura sólido contendo fosfato de cálcio. A avaliação da solubilização de fosfato foi feita por meio do valor do halo translúcido que se forma em torno das colônias bacterianas solubilizadoras. Para identificação do potencial de síntese de compostos indólicos as bactérias foram crescidas em placas de Petri contendo meio sólido de triptona de soja suplementado com triptofano, e cobertas por membrana de nitrocelulose. A membrana foi coletada, e posteriormente adicionado reagente Salkoswski e incubadas no escuro. A formação do halo rosa no local onde havia colônia foi o indicador da síntese de indol. A avaliação das bactérias com potencial de solubilização de óxido de zinco foi realizada por meio do crescimento bacteriano em placas de Petri com meio de cultura sólido contendo óxido de zinco e posterior avaliação do halo de solubilização. A promoção do crescimento de plantas pelos isolados foi avaliada por meio da inoculação em mudas de tomateiro do cultivar San Marzano, semeadas em bandejas de plástico de 128 células com substrato fibra de coco. A inoculação das mudas foi feita 17 dias após semeadura, cada planta recebeu 1 mL de meio DYGS contendo as bactérias selecionadas e o controle recebeu apenas o mesmo meio autoclavado. A adubação das mudas foi feita com solução de Hoaglan à 75%. As mudas foram colhidas aos 35 dias após semeadura e feita a medição das variáveis: volume da raiz, diâmetro do caule, altura de inserção dos cotilédones, altura da muda, relação altura da muda e diâmetro do caule, número de folhas, matéria fresca e seca da raiz, da parte aérea e total. Foi calculado o índice de qualidade de Dickson. Os teores e conteúdos de N, P e K das mudas de tomateiro foram determinados. No total, foram obtidos 29 isolados de bactérias diazotróficas dos tecidos de plantas de tomate do cultivar Grazianni com o uso de diferentes meios de cultivo isentos de nitrogênio. A distribuição de bactérias diazotróficas mostrou-se equitativa no corpo da planta sendo 45% isolado na parte aérea e 55% na raiz. Dos 29 isolados, 12 solubilizaram fosfato de cálcio, 23 solubilizaram óxido de zinco e dois sintetizaram indol, molécula precursora das auxinas. Nas mudas de tomateiro, 12 isolados incrementaram o teor de P e 6 aumentaram o conteúdo de K. Comparadas as médias das variáveis número de folhas, volume da raiz, matéria fresca da raiz, matéria seca da raiz, matéria fresca total e altura da muda, não apresentaram diferenças estatísticas para o teste de Scott Knott à 5% de probabilidade. Para as variáveis matéria fresca da parte aérea, matéria seca da parte aérea e matéria seca total as análises estatísticas mostraram diferenças significativas entre as médias, entretanto o controle estava contido dentro do grupo com melhor desempenho, indicando que as bactérias não tiveram efeito no acréscimo destas variáveis nas condições do ensaio. Conclui-se que diferentes estirpes de bactérias diazotróficas habitam naturalmente plantas de tomate, são capazes de solubilizar fosfato de cálcio, óxido de zinco, sintetizar indol, e promover incrementos nos teores de P e K em mudas de tomateiro.

Plant growth promoting bacteria (BPCP) and within this group the diazotrophic, having different results in view of their influence on plant growth and development, the results may be positive, negative or have no response with statistical significance. Among the most sought after effects are their influence on nutrient supply. The tomato is a widely cultivated crop in Brazil and in the world, its consumption is part of the daily diet of the majority of the population and for its production it is necessary a high supply of fertilizers. The production of seedlings is an important step in the cultivation of tomatoes and it is hypothesized that BPCP can assist in the growth and nutrition of tomato plants. This work aimed to isolate, characterize and select plant growth promoting bacteria that have synergy as the tomato crop. The works were conducted at the Federal University of Viçosa, Campus Florestal. For the isolation of the bacteria samples of 10g of each organ of the plant (root, stem, leaf) were collected from tomato, ground in 90 mL of saline solution and serial dilutions of 10 -2 to 10 -6 . From each of the dilutions, 100 μL aliquots were placed in triplicate in glass penicillin flasks containing the nitrogen-free semi-solid media: NFb, JNFb, JMV, JVMM, JMVL, LGI, LGIP, NFbM and LGIM. Quantification of the bacteria present in the culture media was performed by the most probable number technique (MPN). The resulting colonies were characterized according to the cell morphology (shape and color of Gram) and the characteristics of the colonies (shape, color, size, elevation, border, surface, mucus). To identify the phosphate solubilizing character, the isolates were grown in solid culture medium containing calcium phosphate. The evaluation of the phosphate solubilization was done through the diameter of the translucent halo that forms around the bacterial solubilizing colonies. To identify the potential for synthesis of indole compounds, the bacteria were grown in Petri dishes containing tryptican-supplemented soybean tripticasein solid and covered with nitrocellulose membrane. The membrane was collected, and subsequently added Salkoswski reagent and incubated in the dark. The formation of the pink halo at the colony site was the indicator of indole synthesis. The evaluation of bacteria with zinc oxide solubilization potential was carried out by means of bacterial growth in Petri dishes with zinc oxide-containing solid culture medium and subsequent evaluation of the solubilization halo. The promotion of plant growth by the isolates was evaluated by inoculation in tomato seedlings of the cultivar San Marzano, seeded in plastic trays of 128 cells with substrate coconut fiber. The inoculation of the seedlings was done 17 days after sowing, each plant received 1 mL of DYGS medium containing the selected bacteria and the control received only the same autoclaved medium. The fertilization of the seedlings was done with Hoaglan solution at 75%. The seedlings were harvested at 35 days after sowing and the variables were measured: root volume, stem diameter, height of cotyledon insertion, height of seedling, height of seedlings and stem diameter, number of leaves, fresh matter and dry root, shoot and total dry matter. The Dickson quality score was calculated. The contents and contents of N, P and K of the tomato seedlings were determined. In total, 29 isolates of diazotrophic bacteria from the tissues of tomato plants of the Grazianni cultivar were obtained with the use of different nitrogen - free culture media. The distribution of diazotrophic bacteria was shown to be equal in the body of the plant being 45% isolated in the aerial part and 55% in the root. Of the 29 isolates, 12 solubilized calcium phosphate, 23 solubilized zinc oxide and two synthesized indole, the auxin precursor molecule. In the tomato seedlings, 12 isolates increased the P content and 6 increased the K content. Compared to the mean number of leaves, root volume, root fresh matter, root dry matter, total fresh matter and seedling height, did not present statistical differences for the Scott Knott test at 5% probability. For the variables fresh matter of aerial part, shoot dry matter and total dry matter the statistical analyzes showed significant differences between the means, however the control was contained within the group with better performance, indicating that the bacteria had no effect in the addition of these variables under test conditions. It is concluded that different strains of diazotrophic bacteria naturally inhabit tomato plants, are able to solubilize calcium phosphate, zinc oxide, synthesize indole, and promote increases in the levels of P and K in tomato seedlings.