Construção de um sistema de expressão da proteína não estrutural (NS1) do vírus dengue-2 em Nicotiana tabacum "Havana" e análise da expressão do transgene

Abstract

A dengue é a doença mais importante causada por arbovírus no mundo, sendo observado nos últimos vinte anos um aumento significativo na atividade epidêmica, expansão da distribuição geográfica, transmissão contínua de vários sorotipos e emergência da Febre hemorrágica (DHF) em áreas onde a doença não era prevalente. Apesar dos processos metodológicos de diagnóstico da dengue estar na atualidade em profundo desenvolvimento e aperfeiçoamento, um empecilho na realização de testes diagnósticos para dengue reside na dificuldade de produção em grande escala de antígenos a serem usados na captura do anticorpo presente no soro de pacientes infectados. Devido a este fator, o objetivo é a obtenção de antígeno em grandequantidade e qualidade utilizando um sistema de expressão heteróloga de proteínas em plantas. Para tanto, foi extraído o RNA total do sobrenadante de cultura de células infectadas e a partir deste foi sintetizado o cDNA. O gene da proteína não estrutural (NS1) do sorotipo dengue 2 foi obtido através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR), separado por eletroforese e purificado. O gene foi, então, clonado em vetores pGEM-T e pCAMBIA. Bactérias Escherichia coli DH5α foram transformadas, selecionadas em meio seletivo e estocadas a -80º C. O vetor pCAMBIA foi anteriormente clivado com as mesmas enzimas e o gene da proteína NS1 foi ligado a este por enzima T4 ligase. Nova transformação de E. coli DH5α foi realizada e as colônias foram, então, analisadas quanto a presença do gene que codifica a proteína NS1 através de Reações em Cadeia da Polimerase (PCR). As colônias transformantes recombinantes foram selecionadas e estocadas. Este vetor recombinante, pCAMBIA 3301/NS1, foi utilizado para transformação de Agrobacterium tumefaciens e, posteriormente, de Nicotiana tabacum para expressão da proteína não-estrutural NS1. A extração do DNA e do RNA proveniente das plantas do tabaco foi realizada. A integração do gene da proteína NS1 no genoma vegetal e sua transcrição foram confirmadas por PCR. Análises subsequentes serão realizadas para verificar a expressão efetiva da mesma, que será purificada e concentrada.

The dengue is the most important arbovirus disease in the world, being observed in the last twenty years a significant increase in the epidemic activity, expansion of the geographical distribution, continuous transmission of several sorotypes and emergency of the Hemorrhagic Fever (DHF) in areas where the disease was not prevalent. In spite of the methodological processes of the dengue's diagnosis are in deep development and improvement, a difficulty in the accomplishment of diagnostic tests for dengue lives in the difficult production of antigens in great scale to be used in the capture of the present antibody in the infected patients serum. Thus, our aim in this work is to obtain antigen in great amount and quality using a system of heterologous expression of proteins in plants. To achieve that, total RNA of the culture supernatant of infected cells was extracted and the cDNA was made. The gene of the non structural protein (NS1) of the sorotype dengue-2 was obtained by Polimerase Chain Reactions (PCR), separate by eletroforesis and purified. The gene was, then, cloned in pGEM-T and pCAMBIA vectors. Escherichia coli DH5α were transformed, selected in selective medium and stored at -80 °C. The vector pCAMBIA was previously cleaved with the same enzymes and the gene of the NS1 protein was binded to it. New transformation of E. coli DH5α was accomplished and the colonies were, then, analyzed for the presence of NS1 gene by PCR. The transformed recombinant colonies were selected and stored. The recombinant vector, pCAMBIA 3301/NS1, was used for transformation in Agrobacterium tumefaciens and, later, in Nicotiana tabacum for expression of the non-structural protein NS1. DNA and RNA extraction from the tobacco plants was accomplished. The integration of the NS1 protein gene in the plant genome and its transcription were confirmed by PCR. Subsequent analyses will be accomplished to verify its effective expression, and it will be further purified and concentrated.