Circovírus suino tipo 2 (PCV2): caracterização molecular e construção de vetores para expressão da proteína do capsídeo

Abstract

O genoma do PCV apresenta aproximadamente 1.760 pb, composto de uma molécula de DNA fita simples, circular e de duas principais fases de leitura aberta (ORFs): ORF1 que codifica a replicase viral e ORF2 que codifica a proteína da cápside viral. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular de um isolado de PCV2 e produzir um vetor de expressão contendo a seqüência do capsídeo viral. O DNA de PCV2, extraído de células SK6 infectadas, foi amplificado por PCR e, em seguida, confirmado por seqüenciamento. Após a confirmação do isolamento, todo o genoma viral foi amplificado por PCR, inserido em um vetor de clonagem, e o clone recombinante foi submetido a reações de seqüenciamento. Foram realizados ensaios de PCR que amplificavam o segmento gênico do capsídeo viral e o produto de amplificação foi inserido em um vetor de expressão. Este DNA plasmidial foi transfectado em células SK6 livres de PCV. A expressão da proteína viral foi confirmada por imunofluorescência indireta. A análise da seqüência completa de nucleotídeos da ORF1 e parcial ORF2 do clone contendo todo genoma viral mostrou respectivamente, 99,27% e 97,99% de identidade com as demais seqüências disponíveis no GenBank. Atualmente, não há nenhum método vacinal disponível no mercado para o controle da circovirose suína. Os resultados obtidos neste trabalho serão de grande importância para o início de estudos de vacinações em modelos animais.

PCV presents a single-stranded circular DNA genome of approximately 1760 bp, with two main open reading frames (ORFs): ORF1 that encodes viral replicase and ORF2 that encodes viral capsid protein. The aim of this work was to perform a molecular characterization of a PCV2 isolate and produce an expression vector containing the sequence of viral capsid protein. PCV2 DNA extracted from infected SK6 cells, was amplified by PCR and then confirmed by sequencing. After confirmation of PCV2 isolation, all viral genome was amplified by PCR and inserted in a cloning vector, and the recombinant clone was sequenced. To ORF2 subcloning, PCR assays that amplified the genomic segment of capsid protein were performed and the PCR product was inserted in an expression vector. This plasmidial DNA was transfected in SK6 cells free of PCV. The expression of the viral protein was confirmed by indirect imunofluorescence methods. ORF1 complete nucleotide sequence analysis and ORF2 partial nucleotide sequence analysis revealed respectively, 99.27% and 97.99% of identity with sequences retrieved from GenBank. Until now there is no available vaccinal method to control swine circovirosis. The results obtained in this work will be of great importance to the beginning of vaccination studies in animal models.