Filogenia e filogeografia do porcine circovirus 2 (PCV2), construção e caracterização de um adenovírus recombinante que expressa a proteína do capsídeo do PCV2

Abstract

O circovirus suíno 2 (PCV2) é o principal agente causador da síndrome da postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) e está associado a diferentes síndromes em suínos. O genoma do PCV2 possui três ORFs principais, sendo a ORF2 a codificadora da proteína do capsídeo. No primeiro estudo, sequências de nucleotídeos da ORF2 de 30 isolados brasileiros foram analizadas e comparadas com outras sequências depositadas no GenBank usando uma abordagem filogenética e filogeográfica. No segundo estudo, a fim de controlar a circovirose suína, nós construímos um sistema de expressão gênica da ORF2 do PCV2 em vetor adenovírus. Primeiramente, um total de onze amostras de seis estados brasileiros foram coletadas e as ORF2 foram clonadas em vetor pGEM T-easy e sequenciadas. Nossos resultados, portanto, mostraram uma alta variabilidade de sequências no Brasil além de os isolados brasileiros serem classificados nos subgrupos 1AB, 2D e 2, e que o vírus foi introduzido no Brasil mais que uma vez. Em seguida, a ORF2 de um desses isolados foi amplificada pela reação da polimerase em cadeia (PCR) e clonada em vetor pGEM T-easy. Células de Escherichia coli DH5α foram transformadas com o plasmídeo recombinante (pGEM-ORF2) e o material genético amplificado. A clonagem foi confirmada por sequenciamento e ensaio de restrição com a enzima EcoRI. Confirmada a clonagem, o plasmídeo foi clivado pelas enzimas AclI e NheI, liberando a ORF2. Este segmento foi clonado no vetor pAD5-Blue previamente clivado pelas enzimas ClaI e XbaI. Células de E. coli TOP10 foram transformadas com a construção (pAd5-Blue ORF2); as colônias recombinantes foram selecionadas e o material genético multiplicado. Este plasmídeo foi linearizado pela enzima PacI e trasnfectado em células da linhagem HEK 293. A expressão viral in vitro foi confirmada por imunoperoxidase em monocamada, Western blotting e imunofluorescência. Os vírus purificados foram titulados em 2 x108 TCID50/50μL. Duas doses de vírus purificado foram inoculadas em camundongos BALB/c para verificação da resposta imune. Soro e baço dos animais foram coletados para ensaios de resposta humoral e celular, respectivamente. A resposta imune celular se caracterizou por uma eficiente expressão de mRNA de INF-γ bem como a proliferação de linfócitos T CD8+. Em relação à resposta humoral, o candidato vacinal apresentou produção de anticorpos principalmente após a segunda dose evidenciado na coleta de soro do dia 45. De acordo com os resultados encontrados neste trabalho, acredita-se que este modelo de vacina possa ser utilizado em suíno SPF e convercional uma vez que em modelo murino, o adenovírus recombinante foi capaz de estimular resposta imune celular, em especial linfócitos T CD8+, o que destaca eficiênica na eliminação do PCV2.

The porcine circovirus 2 (PCV2) is the main agent causing the postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) and is associated with different syndromes in pigs. The genome of PCV2 has three major ORFs, the ORF2 encodes a protein of capsid. First in this study, the ORF2 nucleotide sequences of 30 Brazilian isolates were analyzed and compared to other GenBank sequences using phylogenic and phylogeographic approaches. Secound, in order for the control of swine circovirose, our constructed a system of gene expression of the RF2 of PCV2 in an adenovirus vector. The first work, a total of eleven samples of six Brazilian states were collected and the ORF2 were cloned into vector pGEM T-easy and sequencing. Our results show high sequence variability in Brazil, since, in this work, the Brazilian isolates were classified into subgroup 1AB, 2D and 2, which reveals that the virus was introduced in Brazil more than once. The second work, one this isolate of ORF2 was amplified by the polymerase chain reaction (PCR). Cells of Escherichia coli DH5α were transformed with the recombinant plasmid (pGEM-ORF2) and amplified genetic product. The cloning was confirmed by and a test of the restriction enzyme EcoRI. Confirmed the cloning, the plasmid was cleaved by restriction enzyme NheI and AclI, releasing the ORF2. This segment was cloned in the vector-Blue pAD5 previously cleaved with the enzymes XbaI and ClaI. Cells of E. coli TOP10 were transformed with the construction (pAd5 Blue-ORF2), the recombinant colonies were selected and the genetic product multiplied. This plasmid was cleaved by the enzyme PacI, linearized and trasnfected in HEK 293 cells. The confirmation of viral expression in vitro was detected by Immunoperoxidase Monolayer Assay (IPMA), Western Blotting and Immunofluorescence Assay (IFA) tecnics. The purified viruses were titled in 2 x108 TCID50/50μL. Two doses of purified virus were inoculated into BALB/c animals to check the immune response. Serum and spleen of animals were collected for testing the humoral and cellular response respectively. The cellular immune response marked a high expression of mRNA for INF-γ and high proliferation of CD8+ T cells. Regarding the humoral response, the candidate vaccine showed antibody production after the second dose mainly evidenced in the collected of serum of day 45. According to the results found in this work, this type of vaccine can be used in SPF and convercional pigs since in mouse model, the recombinant adenovirus was able to stimulate cellular immune response, particularly cells T CD8+, that emphasizes the elimination of PCV2.