Use este identificador para citar ou linkar para este item: https://locus.ufv.br//handle/123456789/2439
Tipo: Dissertação
Título: Identificação e caracterização de alvos celulares da proteína NIG (NSP-Interacting GTPase)
Título(s) alternativo(s): Identification and characterization of cellular targets of the protein NIG (NSP-Interacting GTPase)
Autor(es): Machado, João Paulo Batista
Primeiro Orientador: Fontes, Elizabeth Pacheco Batista
Primeiro coorientador: Carvalho, Claudine Márcia
Segundo coorientador: Martins, Gilberto Sachetto
Primeiro avaliador: Zerbini Júnior, Francisco Murilo
Segundo avaliador: Santos, Anésia Aparecida dos
Abstract: A proteína NSP (nuclear shuttle protein) de geminivírus facilita o transporte intracelular do DNA viral do núcleo para o citoplasma e atua juntamente com a proteína MP (movement protein) na propagação do DNA viral para células adjacentes. No entanto, o mecanismo pelo qual NSP medeia o movimento nucleocitoplasmático do DNA viral não é conhecido. Recentemente, foi identificada uma GTPase, denominada NIG (NSP-interacting GTPase), cujas propriedades estruturais e bioquímicas indicam um possível envolvimento no transporte nucleocitoplasmático do genoma viral, atuando como cofator específico de NSP. Com o objetivo de determinar a função celular de NIG, e assim verificar se esta GTPase desempenha algum papel na translocação do genoma viral, foi realizada uma triagem de proteínas que interagem com o domínio C-terminal (Pro-Rich) de NIG, por meio do sistema de duplo híbrido em leveduras. A estirpe de levedura AH109, previamente transformada com pBDPro- Rich, foi co-transformada com a biblioteca de cDNA de Arabidopsis thaliana, clonada no vetor pEXP-AD502. Os duplos transformantes foram selecionados em meio deficiente dos aminoácidos leucina e triptofano. A seleção da interação entre BD-Pro-Rich e proteínas codificadas pela biblioteca de cDNA fusionadas ao domínio de ativação de Gal4 (AD) foi feita em meio deficiente de histidina, suplementado com 10 mM de 3AT. Entre os cinco cDNAs isolados que apresentaram prototrofia à histidina e atividade de β-galactosidase, CSN5A e At2G41020 foram selecionados para análises mais detalhadas. CSN5A (COP9 Signalosome 5A) é um dos componentes do complexo COP9 signalossomo (CSN) e consiste na subunidade responsável pela atividade de isopeptidase exibida por este complexo. A proteína At2G41020 não possui função conhecida e tem sido associada à maquinaria de spliceossomo, devido à sua homologia com a proteína Npw38 de humanos. A interação in vivo entre NIG e CSN5A ou At2G41020 foi demonstrada por ensaios de complementação de fluorescência bimolecular (BiFC) e parece ocorrer no núcleo, bem como em agregados citoplasmáticos. A confirmação da interação entre NIG e CSN5A in vivo foi reforçada por meio de ensaio de co-imunoprecipitação. A proteína CSN5A, fusionada à GFP, localiza-se tanto no núcleo como no citoplasma, enquanto que a proteína quimérica At2G41020-GFP está localizada predominantemente no núcleo, consistente com um possível envolvimento com o spliceossomo. Embora tenha sido demonstrado que a proteína NIG está localizada no citosol, a coexpressão de YFP-NIG com CSN5A-GFP ou com At2G41020-GFP resultou no seu redirecionamento para o núcleo. Coletivamente, estes resultados apontam CSN5A e At2G41020 como alvos na elucidação do papel funcional de NIG no transporte celular de macromoléculas.
The geminivirus nuclear shuttle protein (NSP) facilitates the intracellular transport of viral DNA from the nucleus to the cytoplasm and acts along with the movement protein (MP) to translocate the viral DNA to adjacent cells. However, the mechanism by which NSP mediates the nucleocytoplasmic movement of the viral DNA is unknown. Recently, a GTPase, designated NIG (NSP-interacting GTPase), which displays biochemical and structural properties consistent with a role in the nucleocytoplasmic transport of viral DNA, has been identified. NIG may act as a cellular cofactor for NSP function. To assess the potential role of NIG in general cellular nucleocytoplasmic transport of protein complexes, we performed yeast two-hybrid screens with a Pro-rich domain of NIG as bait. The yeast strain AH109, previously transformed with pBD-Pro-Rich, was cotransformed with a cDNA library from Arabidopsis thaliana cloned into pEXPAD502 vector. Double transformants were selected on medium lacking leucine and tryptophan. To select for interactions between the bait BD-Pro-Rich and Arabidopsis cDNA library-encoded proteins, double transformants were plated on medium lacking His and supplemented with 10mM 3AT. Among five isolated cDNAs that displayed His prototrophy and β-galactosidase activity, CSN5A and At2G41020 were selected for further analyses. CSN5A (COP9 Signalosome 5A) is one of the components of COP9 signalosome complex (CSN) and corresponds to the subunit responsible for the isopeptidase activity displayed by this complex. The function of the deduced protein from At2G41020 is unknown but has been associated with the spliceosome machinery due to its homology to the human Npw38. Interactions between NIG and CSN5A or At2G41020 were also detected in vivo by bimolecular fluorescence complementation (BiFC) assays and appear to occur in the nucleus and in cytosolic aggregates. The in vivo interaction between NIG and CSN5A was further confirmed by co-immunoprecipitation assays. A CSN5A-GFP fusion was located in the nucleus and cytoplasm, whereas At2G41020-GFP was predominantly localized in the nucleus, consistent with its possible involvement with the spliceosome. Although NIG has been shown to be located in the cytoplasm, co-expression of YFP-NIG with CSN5AGFP or At2G41020-GFP resulted in its relocation to the nucleus. Collectively, these results indicate that CSN5A and At2G41020 may be targets for the elucidation of the functional role of NIG in the cellular transport of macromolecules.
Palavras-chave: (NSP-Interacting GTPase)
Alvos celulares
(NSP-Interacting GTPase)
Cellular targets
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal
Programa: Mestrado em Bioquímica Agrícola
Citação: MACHADO, João Paulo Batista. Identification and characterization of cellular targets of the protein NIG (NSP-Interacting GTPase). 2011. 85 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2011.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2439
Data do documento: 20-Jul-2011
Aparece nas coleções:Bioquímica Agrícola

Arquivos associados a este item:
Arquivo Descrição TamanhoFormato 
texto completo.pdf1,37 MBAdobe PDFThumbnail
Visualizar/Abrir


Os itens no repositório estão protegidos por copyright, com todos os direitos reservados, salvo quando é indicado o contrário.