Locus  

Construção de cassetes de expressão lineares e transformação de Kluyveromyces marxianus para expressão de proteínas heterólogas

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dc.creator Santos, Ancély Ferreira dos
dc.date.accessioned 2015-03-26T13:07:34Z
dc.date.available 2012-10-22
dc.date.available 2015-03-26T13:07:34Z
dc.date.issued 2012-02-15
dc.identifier.citation SANTOS, Ancély Ferreira dos. Construction of linear expression cassetes na transformation of Kluyveromyces marxianus for heterologous protein expression. 2012. 72 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2012. por
dc.identifier.uri http://locus.ufv.br/handle/123456789/2442
dc.description.abstract A escolha da levedura hospedeira para produção de uma proteína heteróloga é fundamental para o sucesso de um processo biotecnológico, porém, apesar da diversidade de trabalhos com expressão de proteínas em leveduras, os níveis de secreção nesses organismos ainda são considerados baixos quando comparadas aos fungos filamentosos. A levedura K. marxianus possui grande potencial biotecnológico para fermentação e produção de proteínas. Apesar desse potencial existem poucos trabalhos relatando a expressão heteróloga de proteínas nessa levedura. Este quadro demonstra a necessidade de mais estudos para padronização de um sistema fácil e eficiente para obtenção de K. marxianus recombinantes para produção de proteínas de interesse. O objetivo deste trabalho foi padronizar a construção de cassetes lineares para expressão de proteínas heterólogas em K. marxianus. Os cassetes de expressão foram construídos pela técnica de PCR de fusão. Para tanto foi realizado um primeiro ciclo de reação na qual foi amplificado individualmente cada fragmento integrante do cassete (o promotor, o gene de interesse e a marca de seleção). Os promotores escolhidos, ScHXT1p, ScPGKp, ScTDH3p, KmINU1p e KmPCPL3p, foram amplificados do genoma de S. cerevisiae ou K. marxianus. Os genes das enzimas endoglucanase e celobiohidrolase de Aspergillus níger (eng1e cbhA) foram clonados no vetor KLAC1 e este foi utilizado como molde para amplificação da sequência dos genes flanqueados pelas sequências do peptídeo sinal α-mating factor de Kluyveromyces lactis e do terminador do gene lac4 de Kluyveromyces lactis. A sequência codificadora do gene KanMX, marca de seleção que confere resistência em eucariotos para o antibiótico geneticina (G418), foi amplificado do DNA genômico de uma linhagem mutante de S. cerevisiae. O segundo passo consistiu da reação de fusão dos fragmentos de cada promotor com os fragmentos αMF-gene-TT e KanMX por PCR. Esse tipo de construção se mostrou eficiente, reprodutível e passível de ser realizada em tempo muito inferior àquele de métodos de clonagem tradicionais. Os cassetes construídos foram utilizados na transformação de leveduras Kluyveromyces marxianus UFV-3 por dois métodos, acetato de lítio e eletroporação. O protocolo de acetato de lítio foi mais eficiente e as colônias obtidas foram selecionadas por resistência às concentrações crescentes de G418. pt_BR
dc.description.abstract Selection of the most suitable yeast host for heterologous protein expression is important for the success of a biotechnological process. However despite the diversity of works with protein expression in yeasts the secretion level in these organisms are still low when compared with filamentous fungi. The yeast Kluyveromyces marxianus has a great potential for fermentation and protein production. Although, there are few studies reporting heterologous expression in this yeast. It shows the need for more studies to develop an efficient system for the recombinant protein production in this yeast. The aim of this work was the construction of linear cassettes for expression heterologous proteins in K. marxianus. The cassettes were constructed by fusion PCR. For this purpose we performed a first reaction cycle in which each fragment was amplified individually (the promoter, the gene of interest and the selection mark). The promoters (ScHXT1p, ScPGKp, ScTDH3p, KmINU1p and KmPCPL3p) were amplified from the genome of S. cerevisiae and K. marxianus. The endoglucanase and celobiohidrolase genes from A. niger (eng1 and cbhA) were cloned in pKLAC1 vector that was then used as template to amplify the sequence of genes flanked by the sequences of the Kluyveromyces lactis signal peptide α-mating factor and LAC4 gene terminator. The gene KanMX, which confers resistance to geneticin (G418) in eukaryotes, was amplified from genome of a S. cerevisiae mutant. The second step was a fusion PCR reaction of the fragments: the promoter desired, α-MF-gene of interest-TT and the KanMX. This construction was efficient, reproducible and capable of being held in a shorter time than tradicional cloning methods. The constructions were used in K. marxianus UFV-3 transformation by two different methods, the lithium acetate and electroporation. The lithium acetate protocol was more efficient and the transformants were selected by resistance to increased G418 concentrations. eng
dc.description.sponsorship Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
dc.format application/pdf por
dc.language por por
dc.publisher Universidade Federal de Viçosa por
dc.rights Acesso Aberto por
dc.subject Kluyveromyces marxianus por
dc.subject Proteínas heterólogas por
dc.subject Kluyveromyces marxianus eng
dc.subject Heterologous protein eng
dc.title Construção de cassetes de expressão lineares e transformação de Kluyveromyces marxianus para expressão de proteínas heterólogas por
dc.title.alternative Construction of linear expression cassetes na transformation of Kluyveromyces marxianus for heterologous protein expression eng
dc.type Dissertação por
dc.contributor.advisor-co1 Fietto, Juliana Lopes Rangel
dc.contributor.advisor-co1Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4790238D0 por
dc.contributor.advisor-co2 Ribon, Andréa de Oliveira Barros
dc.contributor.advisor-co2Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4727026E6 por
dc.publisher.country BR por
dc.publisher.department Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal por
dc.publisher.program Mestrado em Bioquímica Agrícola por
dc.publisher.initials UFV por
dc.subject.cnpq CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR por
dc.creator.lattes http://lattes.cnpq.br/8649484076855846 por
dc.contributor.advisor1 Fietto, Luciano Gomes
dc.contributor.advisor1Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4763824H8 por
dc.contributor.referee1 Paula, Sérgio Oliveira de
dc.contributor.referee1Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4767540P4 por
dc.contributor.referee2 Castro, Ieso de Miranda
dc.contributor.referee2Lattes http://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4787281A9 por


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  • Bioquímica Agrícola [208]
    Teses e dissertações defendidas no Programa de Pós-Graduação em Bioquímica Agrícola

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