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Tipo: Dissertação
Título: Indução do promotor GmNAC6 por elicitores de estresses e mapeamento de regiões reguladoras
Título(s) alternativo(s): Induction of the promoter GmNAC6 by elicitors of stress and mapping of regulatory regions
Autor(es): Rosado, Gustavo Leão
Primeiro Orientador: Fontes, Elizabeth Pacheco Batista
Primeiro coorientador: Ramos, Juliana Rocha Lopes Soares
Segundo coorientador: Fietto, Luciano Gomes
Primeiro avaliador: Ventrella, Marília Contin
Segundo avaliador: Alves, Elisa Cristina Soares de Carvalho
Abstract: As proteínas que contém o domínio NAC são específicas de plantas e são representadas por uma família gênica grande de fatores transcricionais implicados em diversos aspectos de desenvolvimento e respostas a estresses. A proteína GmNAC6 foi recentemente identificada como componente downstream da via de sinalização de morte celular mediada pelas proteínas NRPs (N-rich proteins) e induzida por estresses no retículo endoplasmático (RE) e osmótico. Este trabalho teve como objetivo principal caracterizar a atividade do promotor de GmNAC6 em respostas a diferentes estímulos bióticos e abióticos, focando na identificação de possíveis cis-elementos regulatórios que controlam a expressão do gene em resposta a diferentes estresses. Para tanto, a região promotora do gene GmNAC6 (1Kb) foi isolada do banco de dados e fusionada com o gene repórter GUS. Essas construções foram integradas no genoma de plantas de tabaco por meio de transformação mediada por Agrobacterium a fim de avaliar a ativação transcricional do gene GmNAC6 tecido-específica e induzida por diferentes estímulos. Os transformantes primários foram monitorados por PCR e expostos a diferenes hormônios e tratamento de estresses, como tunicamicina, polietileno glicol, cicloheximida, BAP, ácido salicílico, ácido jasmônico e ácido abscísico. Em seguida, a atividade do gene repórter foi avaliada qualitativamente por análise histoquímica e quantitativamente por analise fluorimétrica. Exceto por PEG que não induziu o promotor nos tecidos vasculares do caule, os demais estímulos induziram um padrão uniforme de atividade do promotor NAC6. Contudo o nível de expressão variou com o tipo de tecido. Consistente com o envolvimento de GmNAC6 em morte celular, a atividade de GUS foi mais pronunciada em tecidos mais velhos, exceto por tratamento com ABA que induziu altos níveis de atividade do promoter em folhas jovens. Similarmente, o nível relativo de expressão de GUS pareceu significativamente mais alto em tecidos sob diferenciação. Por meio de deleções de regiões do promotor e analise in sílico de putativos cis-elementos responsivos a estímulos em promotores de plantas, foi possível delimitar módulos discretos no promotor de NAC6 contendo vários elementos regulatórios positivos e negativos com o potencial de influenciar a indução do promotor aos estímulos testados. O promotor em estudo foi induzido por todos os estresses testados, sendo induzido mais fortemente por hormônios que regulam a senescência e a resposta biótica, como ataque de patógenos e ferimento. Foi demonstrado também que o promotor é induzido pelas proteínas NRPs, evidenciando a participação na via integrativa que vai culminar em morte celular. O promotor também foi induzido por NAC32, uma proteína da mesma família NAC e que foi identificada previamente por meio de sua capacidade de interagir com NAC6. Coletivamente esses resultados indicam que a indução do gene NAC6 a diferentes estresses e hormônios ocorre no nível transcricional por meio de módulos discretos do promotor que contem cis-elementos regulatórios positivos e negativos. Além disso, os presentes resultados confirmam a participação de NAC6 como componente da via de resposta a estresses no RE e osmótico, mediada pelas proteínas NRPs.
NAC domain-containing proteins are unique to plants and comprise a large gene family of transcriptional factors implicated in diverse aspects of plant development and stress responses. The GmNAC6 was recently identified as a downstream component of the ER (endoplasmic reticulum) stress- and osmotic stress-induced NRP (N-rich proteins)-mediated cell death signaling pathway. This investigation aimed at characterizing the GmNAC6 promoter activity in response to different biotic and abiotic stimuli, focusing on the identification of possible cis-regulatory elements that control GmNAC6 expression. For this, 1-kb 5 flanking sequences of GmNAC6 gene were isolated from the soybean genome, fused to the β-glucuronidase (GUS) reporter gene and introduced in N. tabacum by Agrobacterium-mediated transformation in order to study tissue-specific and stress-induced transcriptional activation of GmNAC6 gene. Primary transformants were monitored by PCR and exposed to different hormones and stress treatments, such as tunicamycin, polyethylene glycol, cycloheximide, BAP, salicylic acid, jasmonic acid and abscisic acid. Gene reporter activity was monitored qualitatively by histochemical analyses and quantitatively by fluorometry. Except for PEG that failed to induce promoter activity in the vascular tissues of stems, all the other treatments promoted a systemic induction of promoter activity in all tissues analyzed, displaying a ubiquitous pattern of cell staining. Nevertheless, the level of expression varied with tissue type. Consistent with the involvement of GmNAC6 in cell death, GUS staining was more prominent in older tissues, except for treatment with ABA that displayed higher levels of promoter activity in young leaves. Likewise, the relative level of GUS expression appeared significantly higher in tissues under differentiation. Deletions of the promoter and in silico analysis of putative cis-elements responsive to stimuli from plant promoters allow the identification of discrete modules on NAC6 promoter harboring putative positive and negative cis-elements potentially capable of interfering with promoter induction. All the tested stimuli induced promoter activity, displaying the highest level of induction to hormones that control senescence and biotic response to pathogens and wounding. Furthermore, the promoter was also induced by NRPs, substantiating the argument that GmNAC6 participates in the ER stress and osmotic stress integrative pathway those results in cell death. GmNAC32, another NAC transfactor identified through interaction with GmNAC6, also induced NAC6 promoter. Taken together, these results indicate that the NAC6 gene is transcriptionally induced by different stresses and hormones through discrete regulatory modules on the promoter that harbor positive and negative cis-elements. Furthermore, the present data confirm that NAC6 acts downstream of NRPs in the cell death stress-induced signaling pathway.
Palavras-chave: GmNAC6
Estresse
Regiões reguladoras
GmNAC6
Stress
Regulatory regions
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal
Programa: Mestrado em Bioquímica Agrícola
Citação: ROSADO, Gustavo Leão. Induction of the promoter GmNAC6 by elicitors of stress and mapping of regulatory regions. 2012. 83 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2012.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2445
Data do documento: 23-Fev-2012
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