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Tipo: Dissertação
Título: Purificação parcial e caracterização bioquímico-cinética de α-galactosidase de Aspergillus terreus
Título(s) alternativo(s): Partial purification and cinetic-biochemistry characterization of α-galactosidase from Aspergillus terreus
Autor(es): Ferreira, Joana Gasperazzo
Primeiro Orientador: Queiroz, José Humberto de
Primeiro coorientador: Ribon, Andréa de Oliveira Barros
Segundo coorientador: Oliveira, Maria Goreti de Almeida
Primeiro avaliador: Fietto, Juliana Lopes Rangel
Segundo avaliador: Pereira, Maria Cristina Baracat
Abstract: A α-galactosidase apresenta grande capacidade para hidrólise de ligações α-1,6 nos oligossacarídeos de galactose (GO) como a rafinose [O-α-Dgalactopiranosil-(1→6)-D-glicopiranosil-(1→2)-β-D-frutofuranosídeo]. Esses açúcares estão presentes nas sementes de soja, e são responsáveis por distúrbios gastrintestinais relacionados com a ingestão de produtos derivados de soja, devido a ausência da enzima α-galactosidase na mucosa intestinal de humanos e animais monogástricos. Dessa forma, a hidrólise dos GO de produtos de soja poderá contribuir para melhorar o seu valor nutritivo. O objetivo desse trabalho foi produzir, purificar e caracterizar uma isoforma extracelular da α-galactosidase do fungo Aspergillus terreus, e avaliar a capacidade da enzima em promover a redução ou eliminação dos oligossacarídeos de galactose presentes em leite de soja. O fungo A. terreus foi cultivado em meio mineral líquido contendo farelo de trigo como fonte de carbono por 7 dias a 28 °C. O extrato enzimático foi submetido à cromatografia em resinas de Sephacryl S-200, Phenyl-Sepharose e DEAE-Sephacel. A última etapa de purificação resultou na enzima parcialmente purificada com um fator de purificação de 26,96 vezes e um rendimento de 19,07%. A massa molecular da enzima foi estimada por eletroforese desnaturante (SDS-PAGE 12,5%) e por cromatografia de exclusão molecular em Sephacryl S-200, de 50 kDa e 77,3 kDa, respectivamente. Atividade máxima da α-galactosidase foi determinada em pH 5,0 e 55 °C. Quando a enzima foi incubada por 6 horas no intervalo de pH 4 6, ela manteve mais de 90% da atividade inicial. A α-galactosidase de A. terreus a 50 °C perdeu 39% de sua atividade após 151 horas de incubação. Na temperatura de 55 °C a enzima conservou 33% de sua atividade após 52 horas de incubação. A 60 °C, a enzima manteve 92% da atividade inicial por 30 minutos. Na temperatura de 55 °C a meia-vida da enzima foi de 35 horas e a 60 °C de 103 minutos. Para os substratos sintéticos, a enzima demonstrou ser muito seletiva, apresentando maior afinidade pelo substrato ρ-NP-αGal. A enzima hidrolisou os substratos naturais melibiose, estaquiose e rafinose, apresentando também capacidade de hidrolisar os polímeros goma guar e goma locusta. O valor de KM ap para o substrato ρ-NP-αGal foi de 0,75 mM, para a melibiose de 7,39 mM, para a rafinose de 32,99 mM e para a estaquiose de 54,74 mM. A atividade enzimática foi totalmente perdida em presença de Ag+ e parcialmente perdida quando em presença de Cu2+ e galactose. Na presença do substrato ρ-NP-αGal a enzima foi inibida competitivamente por galactose (Ki 0,61 mM). A energia de ativação foi calculada para os substratos ρ-NP-αGal (65,85 kJ/mol), melibiose (39,77 kJ/mol), rafinose (42,98 kJ/mol) e estaquiose (47,27 kJ/mol). A enzima α-galactosidase de A. terreus não converteu o sangue tipo B em tipo O. Após 12 horas de incubação da α-galactosidase purificada com leite de soja a 50 °C, pode-se observar que a enzima hidrolisou 100 % da rafinose e 60,3 % da estaquiose, mostrando que a α-galactosidase de A. terreus foi eficiente na redução de GO presentes no leite de soja.
The α-galactosidase has the potencial to hydrolyze α-1,6 linkages in galactose oligosaccharides (GO). These oligosaccharides are considered the major factors responsible for flatulence following ingestion of soybean and other seed legumes, due to the absence of this enzyme in the intestinal mucous membrane of men and monogastrics animals. Therefore, the most important factor for improvement of the soy nutritional value is to eliminate the GO from soy products. The aims of this work was to produce, purify and characterize one extracellular isoform of α-galactosidase from Aspergillus terreus and evaluate the hydrolysis of GO presents in soybean milk. The fungus A. terreus was cultivated in mineral medium containing wheat bran as carbon source for 7 days at 28 °C. The enzymatic extracts were submitted to the chromatography in Sephacryl S-200, Phenyl-Sepharose and DEAE-Sephacel resins. The last purification step resulted in a purification factor of 26.96 times with a recovery of 19.07 %. A molecular mass of 50 kDa was determined by SDS-PAGE white the elution of the α-galactosidase from Sephacryl S-200 showed a molecular mass of 77.3 kDa. The maximum activities of the α-galactosidase were detected in pH 5.0 at 55 °C. The enzyme maintained 90 % of its original activity after incubation in pH 4 6 at 40 °C. The α-galactosidase lost 39 % of its initial activity after preincubation for 151 hours at 50 °C. At 55 °C the enzyme maintained 33 % of this original activity after 52 hours and at 60 °C 92 % of its initial activity was maintained for 30 minutes. The half-lives at 55 and 60 °C were 35 hours and 103 minutes, respectively. The relative rate of hydrolysis of various substrates were as follows ρ-NP-αGal > melibiose > m-NP-αGal > raffinose > stachyose > locust bean gum > guar gum. The values of KM, ap for ρ-NP-αGal, melibiose, raffinose and stachyose were 0.75, 7.39, 32.99 and 54.74 mM, respectively. The enzyme was totally inhibited by silver nitrate, and partially inhibited by Cu2+ and galactose. In the presence of the substrate ρ-NP-αGal the enzyme showed a competitive inhibition by galactose (Ki 0,61 mM). The energy of activation for ρ-NP-αGal, melibiose, raffinose, and stachyose were 65.85, 39.77, 42.98 and 47.27 kJ/mol, respectively. The α-galactosidase was not able to convert erythrocytes of group B blood cells to group O type cells. The results of treatments of soy milk at 50 °C with α-galactosidase semi-purified for 12 hours showed reduction of 100 % in the raffinose and 60.3 % in the stachyose. Therefore, it can be observed that the α-galactosidase from A. terreus was efficiently reduced the GO present in soy milk.
Palavras-chave: α-galactosidase
Aspergillus terreus
Purificação
α-galactosidase
Aspergillus terreus
Purification
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal
Programa: Mestrado em Bioquímica Agrícola
Citação: FERREIRA, Joana Gasperazzo. Partial purification and cinetic-biochemistry characterization of α-galactosidase from Aspergillus terreus. 2007. 94 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2007.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2468
Data do documento: 28-Fev-2007
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