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Tipo: Tese
Título: Purificação e caracterização parcial de lectina obtida de couve-flor (Brassica oleracea var. Botrytis) e potenciais ações biológicas
Título(s) alternativo(s): Purification and partial characterization of lectin obtained from cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) and potential biological actions
Autor(es): Abranches, Monise Viana
Primeiro Orientador: Oliveira, Leandro Licursi de
Primeiro coorientador: Cardoso, Silvia Almeida
Primeiro avaliador: Fietto, Luciano Gomes
Segundo avaliador: Silva, Cynthia Canedo da
Terceiro avaliador: Peluzio, Maria do Carmo Gouveia
Quarto avaliador: Carvalho, Fernanda Caroline de
Abstract: As lectinas são proteínas capazes de interagir de forma seletiva e reversível com carboidratos. As interações proteína-carboidrato estão envolvidas em muitos processos biológicos, atuando como mediadoras de várias atividades celulares, que incluem: interação célula-célula, célula-matriz, controle do crescimento celular e a apoptose. Além disso, tais interações estão implicadas no desenvolvimento de doenças. Adicionalmente, as lectinas podem promover a eliminação de agentes não próprios pela opsonização e parecem ativar a resposta imune inata. Nesse estudo foi purificada e parcialmente caracterizada uma lectina de couve-flor (Brassica oleracea var. Botrytis). A atividade dessa proteína contra a viabilidade de células tumorais (MDA-MB-231, MCF-7 e HepG2) e sobre a ativação de macrófagos foi avaliada. O processo de purificação da lectina envolveu três etapas cromatográficas (por afinidade em coluna Hitrap Blue HP, por troca catiônica em coluna Hitrap CaptoS e exclusão por peso molecular em coluna Sephadex 200 HR 10/30). Sua massa molecular foi estimada por SDS-PAGE sob condições redutora e não redutora, bem como após tratamento com PNGase. A atividade da proteína sobre eritrócitos humanos e de carneiro, em diferentes temperaturas e valores de pH, na presença de diferentes cátions bivalentes, e sua capacidade de se ligar a diferentes carboidratos foi investigada. A sequência de aminoácidos da porção N-terminal da proteína foi analisada por degradação de Edman em sequenciador automático de proteína (modelo PPSQ-33A, Shimadzu). A viabilidade das células tumorais na presença da lectina pelo ensaio com MTT. Adicionalmente, foi realizado ensaio de fagocitose por macrófagos e estimada a produção de H2O2 e NO- sob a influência da lectina. As etapas cromatográficas proporcionaram uma purificação de 139 vezes. A análise por SDS-PAGE em condições redutora e não redutora revelou uma única banda estimada em 34 kDa. Não foi observada diferença de massa quando a lectina foi previamente tratada com PNGase. Observou-se que a proteína foi capaz de hemaglutinar eritrócitos de humanos (Grupos O e B) e de carneiro. A atividade máxima da proteína se manteve até 60 oC e entre os valores de pH 7 e 8. A lectina apresentou especificidade de ligação a carboidratos complexos (fetuína e asialofetuína) e teve sua atividade hemaglutinante melhorada pelo Mg. A sequência N-terminal da lectina encontrada foi ETRAFREERPSSKIVTIAG. A lectina reduziu a viabilidade das linhagens MDA-MB-231 e HepG2, mas o mesmo não foi constatado para a linhagem MCF-7. Na presença da lectina a fagocitose foi estimulada, bem como a produção de H2O2 e NO-. É sugerido que a proteína estudada é uma nova lectina que pode inibir a proliferação das células MDA-MB-231 e HepG2. Além disso, essa lectina também pode ser explorada como agente imunoestimulador, capaz de auxiliar a imunidade inata, favorecendo a remoção de antígenos não próprios.
The lectins are proteins that interact selectively and reversibly with carbohydrates. Protein-carbohydrate interactions are involved in many biological processes, such as mediator of several cellular activities including cell-cell and cell-matrix recognition, control the cellular growing and apoptosis. Moreover, these interactions are implicated in the development of diseases. Additionally, the lectins can promote foreign agents elimination by opsonization and it seems activating the innate immune response. In this study, a lectin of cauliflower has been purified and partially characterized (Brassica oleracea var. Botrytis). In addition, the protein activity against the viability of tumor cells (MDA-MB-231, MCF-7 e HepG2) and on macrophages activation has been assessed too. The lectin purification involved three chromatographic steps (FPLC-affinity on a Hitrap Blue HP column, FPLC-cation exchange on a Hitrap CaptoS column and HPLC-molecular weight exclusion chromatography on a Sephadex 200 HR 10/30 column). The protein molecular mass was estimated by SDS-PAGE under reducing and non-reducing conditions and after PNGase treatment. The protein activity on human and sheep erythrocytes in different temperature and pH conditions, in the presence of divalent cations, and the protein ability to bind different carbohydrate were investigated. The N-terminal amino acid sequence was analyzed by Edman degradation method in the Shimadzu PPSQ-30 Series Protein Sequencer. The viability of tumor cells in the presence of lectin was investigated by MTT assay. Furthermore, it was performed the macrophage phagocytosis assay and it assessed H2O2 and NO- production under influence of lectin. The purification steps have provided a 139-fold purification. The SDS-PAGE analysis in reducing and non-reducing conditions revealed a single band estimated at 34 kDa. It was not observed any difference in the molecular mass when the lectin was previously treated with PNGase. It was noted that the protein was able to cause hemagglutination of human (O and B groups) and sheep erythrocytes. The protein optimal activity was maintained until 60 OC and between pH 7 and pH 8. The lectin presented a binding specificity to complex carbohydrates (fetuin and asialofetuin) and the Mg has improved the lectin hemagglutinating activity. The N-terminal sequence of the encountered lectin was ETRAFREERPSSKIVTIAG. The lectin reduced the viability of the MDA MB 231 and HepG2 bloodlines, but it did not reduce the viability of the MCF-7 cells. In the presence of lectin the phagocytosis was stimulated, as well as H2O2 and NO- production. It is suggested that the studied protein is a new lectin that can inhibit MDA-MB-231 and HepG2 proliferation. In addition, this lectin can also be probed like immunostimulant agent, capable to help the innate immunity, favoring the clearance of non-self-agents.
Palavras-chave: Aglutinina
Cromatrografia
Imunobiologia
Glicobiologia
Carboidrato
Câncer
Resposta Imune
Agglutinin
Cromatrografia
Immunobiology
Glycobiology
Carbohydrate
Cancer
Immune Response
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Análises quantitativas e moleculares do Genoma; Biologia das células e dos tecidos
Programa: Doutorado em Biologia Celular e Estrutural
Citação: ABRANCHES, Monise Viana. Purification and partial characterization of lectin obtained from cauliflower (Brassica oleracea var. Botrytis) and potential biological actions. 2013. 49 f. Tese (Doutorado em Análises quantitativas e moleculares do Genoma; Biologia das células e dos tecidos) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2013.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/262
Data do documento: 30-Abr-2013
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