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Soybean seed galactinol synthase activity as determined by a novel colorimetric assay

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dc.contributor.author Ribeiro, Marluci
dc.contributor.author Felix, Carlos R.
dc.contributor.author Lozzi, Silene de Paulino
dc.date.accessioned 2019-10-03T14:08:40Z
dc.date.available 2019-10-03T14:08:40Z
dc.date.issued 2000
dc.identifier.issn 0103-3131
dc.identifier.uri http://dx.doi.org/10.1590/S0103-31312000000300004
dc.identifier.uri https://locus.ufv.br//handle/123456789/27219
dc.description.abstract Galactinol synthase (GS) is a key enzyme for the biosynthesis of raffinose oligosaccharides (RO) which are the flatulence factors present in soybean seeds and several other legumes. Understanding of soybean seed GS properties is, therefore, of biotechnological interest. The GS enzyme catalyses formation of galactinol and UDP from UDP-gal and myo-inositol. This enzyme is currently assayed by an isotopic method. We have then idealized a more convenient method for GS assay based on the indirect colorimetric determination of the UDP formed which is then hydrolyzed by exogenous apyrase and the resulting Pi quantified by a modification of the colorimetric method of Fiske & SubbaRow. The color developed is stable, and the method is suitable for detection of very low GS activity. The GS activity profiles of developing soybean seeds determined by the isotopic and the colorimetric methods are closely related. The GS enzyme was partially purified (46-fold) by treatment of seed extract with MnCl2, sequential chromatographies on DEAE-Sepharose, Phenyl-Sepharose CL-4B and Q-Sepharose columns. The crude and the partially purified enzyme showed maximum activity at pH 7.0 and 50 ºC. Dithiothreitol and MnCl2 enhanced considerably the activity of the partially purified enzyme. While UDP-glc could be hydrolyzed by the enzyme at a reative activity corresponding to 49% of that calculated for UDP-gal, UDP-man and sucrose were completely ineffective as alternative substrates. en
dc.description.abstract Galactinol sintase (GS) é a enzima-chave para a biossíntese de oligosacarídeos de rafinose (RO), que são os fatores antinutricionais causadores de flatulência, os quais estão presentes em sementes de soja e em outros legumes. A GS catalisa a formação de galactinol e UDP a partir de UDP-gal e mioinositol. A atividade dessa enzima é determinada atualmente pelo método radioisotópico que, apesar de adequado tecnicamente, apresenta vários inconvenientes, tais como a necessidade de substrato de alto custo, bem como de cuidados adicionais e serviços especializados para descarte dos resíduos radioativos. Assim, desenvolveu-se um método colorimétrico alternativo ao método radioisotópico, baseado na determinação colorimétrica indireta do UDP formado pela hidrólise enzimática (apirase) desse nucleotídeo e determinação do Pi resultante pelo método de Fiske & SubbaRow, com modificações. A cor desenvolvida é estável e o método é sensível para detecção de quantidades nanomolares de Pi. Os perfis de atividade da GS em sementes de soja em diferentes fases de desenvolvimento, determinados pelos métodos colorimétrico e radioisotópico, são semelhantes. Adicionalmente, a GS de sementes de soja foi purificada (46-vezes) por tratamento do extrato das sementes com MnCl2, e uma seqüência de cromatografias em colunas de DEAE-Sepharose, Phenyl-Sepharose CL-4B e Q-Sepharose. As atividades de GS no extrato bruto e na amostra parcialmente purificada foram máximas em pH 7.0 e 50 ºC. Ditiotreitol e MnCl2 aumentaram consideravelmente a atividade da enzima parcialmente purificada. Enquanto UDP-glc pode ser hidrolisado pela enzima com uma atividade relativa correspondendo a 49% da atividade contra UDP-gal, UDP-man e sacarose foram completamente ineficazes como substratos alternativos. Os valores de KM para conversão de UDP-gal e mio-inositol foram de 2,0 mM e 2,93 mM, respectivamente, determinados pelo método de Lineaweaver-Burk. pt-BR
dc.format pdf pt-BR
dc.language.iso eng pt-BR
dc.publisher Revista Brasileira de Fisiologia Vegetal pt-BR
dc.relation.ispartofseries v. 12, n. 03, p. 203- 212, 2000 pt-BR
dc.rights Open Access pt-BR
dc.subject Flatulence pt-BR
dc.subject Galactinol synthase pt-BR
dc.subject Colorimetric assay pt-BR
dc.subject Raffinose oligosaccharides pt-BR
dc.subject Flatulência pt-BR
dc.subject Galactinol sintase pt-BR
dc.subject Ensaio colorimétrico pt-BR
dc.subject Oligosacarídeos de rafinose pt-BR
dc.title Soybean seed galactinol synthase activity as determined by a novel colorimetric assay en
dc.type Artigo pt-BR


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