Biochemical and physiological responses of common bean infected by Sclerotinia sclerotiorum mediated by oxalic acid and phosphites and diagrammatic scale for assessment of white mold severity

Abstract

White mold, caused by Sclerotinia sclerotiorum, is one of the most devastating diseases of common bean worldwide. The wide range of hosts (>400 species) and the fungus’ ability to survive for many years on the soil as sclerotia make disease management very difficult. Despite the importance of white mold, many aspects of the host-fungus interaction remain elusive. Here, a series of experiments was conducted to assess the biochemical and physiological changes mediated by oxalic acid (OA, the main pathogenic material secreted by S. sclerotiorum), phosphites in the common bean-S. sclerotiorum interaction as well as a diagrammatic scale for assessment of white mold severity (WMS). Firstly, we performed biochemical and physiological analyses to investigate the role of oxalic acid (OA) during S. sclerotiorum infection. To this end, common bean plants were sprayed with water or OA (referred to as –OA and +OA plants, respectively) and either challenged or not with a wild type (WT) and an OA-defective mutant (A4) of S. sclerotiorum. Irrespective of OA spray, WT isolate was more aggressive than A4 isolate, and spraying OA increased OA concentration in the leaflets and the aggressiveness of both isolates. Biochemical limitations were found to be behind S. sclerotiorum- induced photosynthetic impairments, notably for the +OA plants inoculated with WT isolate. Inoculated plants were not able to fully capture and exploit the collected energy as a result photochemical dysfunctions, which were potentiated by OA. With exception of catalase activity (CAT), there were increases in the activities of antioxidant enzymes, remarkably for plants that were inoculated with WT isolate. OA attenuated most of such increases, thereby increasing generation of superoxide and hydrogen peroxide and the concurrent damage to the host cell membranes, as evidenced by the increases in malondialdehyde (MDA) concentration. In the second experiment, we investigated physiological changes in common bean plants that were sprayed with water, zinc (Zn) or copper (Cu) phosphites and challenged or not with S. sclerotiorum. In vitro assays revealed that Zn and Cu phosphites inhibited fungal growth in a dose-dependent manner, but the latter was more fungitoxic. Lesion area and white mold severity were reduced by Zn and Cu phosphites, but the former was more effective. Sclerotinia sclerotiorum infection dramatically impaired plant photosynthesis, but such impairments were greatly abrogated in the Zn and Cu phosphite-treated plants. Concentrations of chlorophyll a + b and carotenoids were decreased in inoculated plants, but lower decreases were recorded in the presence of Zn and Cu phosphites. In the last study, we investigated whether Zn and Cu phosphites potentiate biochemical defenses of common bean against white mold. Histopathological analysis showed fewer fungal hyphae and less collapse of the mesophyll cells in the Zn and Cu phosphite-treated plants relative to the control. The S. sclerotiorum-triggered accumulation of reactive oxygen species, OA and MDA were constrained as a result of Zn and Cu phosphites sprays. In general, the activities of the antioxidant and defense enzymes at early stages of pathogen infection were higher in Zn- and Cu-sprayed plants than in their non-sprayed counterparts. Concentrations of total soluble phenols and lignin-thioglycolic acid derivatives in the inoculated plants were not affected by the Cu phosphite treatment, but they were higher and lower, respectively, in the Zn phosphite treatment at 60 hai than in the control. In conclusion, our results showed that OA enhance biochemical limitations to photosynthesis, photochemical dysfunctions and oxidative stress in common bean leaflets during the infection process of S. sclerotiorum. Additionally, we provide novel evidences of the potential of Zn and Cu phosphites in attenuate the physiological impairments and shed light on the biochemical defense mechanisms involved in the Zn and Cu phosphites-mediated suppression of white mold in common bean. In the fourth experiment, we develop SADs consisting of eight color images of diseased leaflets with severity values that ranged from 0.4 to 53.7%. Twenty raters [10 experienced (ER) and 10 inexperienced (IR)] validated the SADs by assessing the same set of 50 images twice, the first without SADs and the second using it as an aid. The SADs significantly improved both accuracy and precision for IR, whereas for ER only precision (r) was improved by SADs. The SWM estimates were also more reliable because inter-rater reliability (coefficient of determination, R 2 ) was significantly increased for both ER and IR by using SADs. Therefore, the SADs presented is thought to be a valuable tool to provide accurate, precise and reliable estimates of the SWM on common bean.

O mofo branco, causado por Sclerotinia sclerotiorum, é uma das doenças mais devastadoras do feijoeiro em todo o mundo. A ampla gama de hospedeiros (> 400 espécies) e a capacidade do fungo de sobreviver por muitos anos no solo, como escleródios, dificultam muito o manejo da doença. Apesar da importância do mofo branco, muitos aspectos da interação fungo-hospedeiro permanecem elusivos. Aqui, uma série de experimentos foi conduzida para avaliar as alterações bioquímicas e fisiológicas mediadas por ácido oxálico (OA, o principal material patogênico secretado por S. sclerotiorum), fosfitos na interação feijão-S. sclerotiorum, bem como desenvolver uma escala para a quantificação da severidade do mofo branco (WMS). Primeiramente, realizamos análises bioquímicas e fisiológicas para investigar o papel do ácido oxálico (OA) durante a infecção por S. sclerotiorum. Para este fim, plantas de feijoeiro foram pulverizadas com água ou OA (referidas como plantas -OA e + OA, respectivamente) e desafiadas ou não com um tipo selvagem (WT) e um mutante deficiente na produção do OA (A4) de S. sclerotiorum. Independentemente do spray OA, o isolado WT foi mais agressivo que o isolado A4, e a pulverização da OA aumentou a concentração de OA nos folhetos e a agressividade de ambos os isolados. Verificou-se que as limitações bioquímicas estavam envolvidas nas deficiências fotossintéticas induzidas por S. sclerotiorum, nomeadamente para as plantas + OA inoculadas com o isolado WT. As plantas inoculadas não foram capazes de capturar e explorar completamente a energia coletada como resultado de disfunções fotoquímicas, que foram potencializadas pela OA. Com exceção da atividade da catalase (CAT), houve aumento nas atividades de enzimas antioxidantes, notavelmente para plantas que foram inoculadas com o isolado WT. A OA atenuou a maioria desses aumentos, aumentando assim a geração de superóxido e peróxido de hidrogênio e o dano concomitante às membranas da célula hospedeira, como evidenciado pelos aumentos na concentração de aldeído malônico (MDA). No segundo experimento, investigamos mudanças fisiológicas em plantas de feijoeiro que foram pulverizadas com fosfitos de água, zinco (Zn) ou cobre (Cu) e desafiadas ou não por S. sclerotiorum. Ensaios in vitro revelaram que os fosfitos de Zn e Cu inibiram o crescimento fúngico de maneira dose-dependente, mas o último foi mais fungitóxico. A área da lesão e a severidade do mofo branco foram reduzidas pelos fosfitos de Zn e Cu, mas o primeiro foi mais efetivo. A infecção por S. sclerotiorum prejudicou dramaticamente a fotossíntese das plantas, mas tais deficiências foram muito anuladas nas plantas tratadas com fosfito de Zn e Cu. Concentrações de clorofila a + b e carotenoides foram reduzidas em plantas inoculadas, mas menores decréscimos foram registrados na presença de fosfitos de Zn e Cu. No último estudo, investigamos se os fosfitos de Zn e Cu potencializam as defesas bioquímicas do feijoeiro contra mofo branco. A análise histopatológica mostrou menos hifas fúngicas e menos colapso das células do mesofilo nas plantas tratadas com fosfito de Zn e Cu em relação ao controle. O acúmulo de espécies reativas de oxigênio, OA e MDA desencadeadas por S. sclerotiorum foi restrito como resultado da pulverização com os fosfitos de Zn e Cu. Em geral, as atividades das enzimas antioxidativas e de defesa nos estágios iniciais da infecção pelo patógenos foram maiores em plantas pulverizadas com Zn e Cu do que em suas contrapartes não pulverizadas. Concentrações de fenóis solúveis totais e lignina derivado do ácido tioglicólico nas plantas inoculadas não foram afetadas pelo tratamento com fosfito de Cu, mas foram maiores e menores, respectivamente, no tratamento com fosfito de Zn a 60 hai do que no controle. Em conclusão, nossos resultados mostraram que OA aumenta as limitações bioquímicas à fotossíntese, disfunções fotoquímicas e estresse oxidativo em folhetos de feijoeiro durante o processo de infecção de S. sclerotiorum. Adicionalmente, nós fornecemos novas evidências do potencial dos fosfitos de Zn e Cu em atenuar as deficiências fisiológicas e lançar luz sobre os mecanismos de defesa bioquímica envolvidos na supressão mediada por fosfitos de Zn e Cu do mofo branco no feijoeiro. No quarto experimento, desenvolvemos SADs que consistiram em oito imagens coloridas de folíolos de feijoeiro doentes com valores de WMS variando de 0,4 a 53,7%. Vinte avaliadores [10 experientes (ER) e 10 inexperientes (IR)] validaram os SADs avaliando o mesmo conjunto de 50 imagens duas vezes, o primeiro sem SADs e o segundo usando-o. Os SADs melhoraram significativamente a acurácia e a precisão para IR, enquanto que para ER apenas a precisão (r) foi melhorada por SADs. As estimativas de WMS também foram mais confiáveis para repetibilidade inter- avaliador (coeficiente de determinação, R 2 ) foi significativamente maior para ER e IR usando SADs. Portanto, os SADs apresentados são uma ferramenta valiosa para fornecer estimativas acuradas, precisas e repetíveis da WMS do feijoeiro.