Phenotypic and molecular characterization of the resistance to quinone outside inhibitors in Fusarium graminearum

Abstract

Fusarium Head Blight (FHB) is a fungal disease of small grains caused mainly by Fusarium graminearum. In Brazil, farmers rely on fungicides to minimize yield losses caused by a complex of foliar and floral diseases, as well as to reduce mycotoxin contamination due to FHB. Usually, a range of active ingredients are used in isolation or dual premixes that include a triazole (DMI) and a quinone outside inhibitor (QoI) fungicides. Comprehensive information on the sensitivity/resistance of F. graminearum to fungicides is available only for DMIs, while for QoI, data are scarce and controversial. A total of 225 strains were studied in this work and they were split into two geographical subcollections: one from Rio Grande do Sul (RS), 125 strains, and other from Paraná (PR), 100 strains. The in vitro sensitivity of F. graminearum isolates was assessed through the conidia germination assay and tested concentrations for azoxystrobin were 0, 0.001, 0.01, 0.1, 1,10 and 100 μg mL-¹, while for pyraclostrobin were 0, 0.05, 0.5, 1.0, 5.0 and 10 μg mL-¹. Effective concentration leading to 50% inhibition (EC 50 ) of conidial germination was obtained based on three-parameter Weibull function. Isolates, in which the EC 50 was not previously determined, were screened by discriminatory doses (DD) for both fungicides. Molecular analysis of the cytb gene was performed and nine isolates were selected and sequenced. The median EC 50 value for azoxystrobin (n = 25) was 2.20 μg mL-¹ in the PR collection and 4.04 μg mL-¹ in the RS collection. For pyraclostrobin (n = 50), the median EC 50 was 0.28 μg mL-¹ in the PR collection and 0.24 μg mL-¹ in the RS collection. These median values are greater than the maximum EC 50 reported in previous works. Shapiro-Wilk test indicated that EC 50 values were normally distributed (P = 0.23), and no significant difference was observed among the collections. A comparison between the two fungicides showed significant differences between them and pyraclostrobin was more fungitoxic than azoxystrobin. There was no significant correlation between the EC 50 values of the two fungicides. Based on the DD, 50% of the strains analysed were classified as less sensitive to azoxystrobin in the PR collection (n = 75) and 28% in the RS collection (n = 100). For pyraclostrobin, 33% of the strains were classified as less sensitive in the PR collection and 18.8% in the RS collection. We also observed an increase in the relative frequency of less sensitivity isolates between five years (2007-2011) in the RS collection. Sequence alignments showed no point mutation in any hot spot (F129L, G137R, G143A) even in the isolates with highly EC 50 . In conclusion, we are able to set a sensitivity profile for F. graminearum populations, however the resistance mechanism associated with QoI fungicides remains unclear. Our study suggested a shift towards less sensitive populations and further studies shall be conducted for monitoring more contemporary isolates from these regions, both in vitro and in vivo experiments, as well as testing other mechanisms of resistance. Keywords. Fusarium Head Blight. Strobilurin. Gibberella zeae. Triticum aestivum

A giberela do trigo é uma doença fúngica de pequenos grãos causada principalmente por Fusarium graminearum. No Brasil, os agricultores contam com fungicidas para minimizar as perdas de produtividade causadas por um complexo de doenças foliares e florais, bem como para reduzir a contaminação por micotoxinas devido à giberela. Normalmente, uma variedade de ingredientes ativos é usado isoladamente ou em pré-misturas que incluem um fungicida triazol (DMI) e um inibidor externo de quinona (QoI). Informações abrangentes sobre a sensibilidade/resistência de F. graminearum a fungicidas estão disponíveis apenas para DMIs, enquanto para QoI, os dados são escassos e controversos. Neste trabalho, foram estudados 225 isolados, os quais foram divididos em duas subcoleções geográficas: uma do Rio Grande do Sul (RS), 125 isolados, e outra do Paraná (PR), 100 isolados. A sensibilidade in vitro de isolados de F. graminearum foi avaliada por meio do teste de germinação de conídios e as concentrações testadas para azoxistrobina foram 0, 0,001, 0,01, 0,1, 1,10 e 100 μg mL-¹, enquanto para piraclostrobina foram 0, 0,05, 0,5, 1,0, 5,0 e 10 μg mL-¹. A concentração efetiva levando a 50% de inibição (EC 50 ) da germinação de conídios foi obtida com base na função de Weibull de três parâmetros. Os isolados, nos quais a EC 50 não foi determinada previamente, foram selecionados por doses discriminatórias (DD) para ambos os fungicidas. A análise molecular do gene cytb foi realizada e nove isolados foram selecionados e sequenciados. O valor mediano de EC 50 para azoxistrobina (n = 25) foi de 2,20 μg mL-¹ na coleção PR e 4,04 μg mL-¹ na coleção RS. Para a piraclostrobina (n = 50), a EC 50 mediana foi de 0,28 μg mL-¹ na coleção PR e 0,24 μg mL-¹ na coleção RS. Esses valores medianos são maiores do que os valores máximo de EC 50 previamente relatados. O teste de Shapiro-Wilk indicou que os valores de EC 50 apresentaram distribuição normal (P = 0,23), não sendo observada diferença significativa entre as coleções. Uma comparação entre os dois fungicidas mostrou diferenças significativas entre eles e, a piraclostrobina foi mais fungitóxica do que a azoxistrobina. Não houve correlação significativa entre os valores de EC 50 dos dois fungicidas. Com base na DD, 50% (n = 75) dos isolados analisados foram classificadas como menos sensíveis à azoxistrobina na coleção PR e 28% na coleção RS. Para a piraclostrobina, 33% (n = 100) das cepas foram classificadas como menos sensíveis na coleção PR e 18,8% na coleção RS. Observamos também um aumento na frequência relativa de isolados de menor sensibilidade entre cinco anos (2007-2011) na coleção RS. Os alinhamentos de sequência não mostraram nenhuma mutação em nenhum hot spot (F129L, G137R, G143A), mesmo nos isolados com altos valores de EC 50 . Em conclusão, nós definimos um perfil de sensibilidade para populações de F. graminearum, no entanto, o mecanismo de resistência associado aos fungicidas QoI permanece incerto. Nosso estudo sugere uma mudança para populações menos sensíveis e novos estudos devem ser conduzidos monitorando isolados mais contemporâneos, tanto em experimentos in vitro quanto in vivo, bem como testando outros mecanismos de resistência. Palavras-chave: Giberela. Estrobilurina. Gibberella zeae. Triticum aestivum.