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Tipo: Dissertação
Título: Extração e purificação de proteínas estruturadoras de gelo obtidas de folhas de trigo
Título(s) alternativo(s): Extraction and purification of ice structuring proteins obtained from wheat leaves
Autor(es): Campelo, Flávia Assunção
Primeiro Orientador: Pirozi, Mônica Ribeiro
Primeiro coorientador: Chaves, José Benício Paes
Segundo coorientador: Vieira, Claudia Regina
Primeiro avaliador: Oliveira, Eduardo Basílio de
Segundo avaliador: Barros, Frederico Augusto Ribeiro de
Abstract: Quando certos organismos são submetidos a temperaturas baixas, eles tendem a desenvolver mecanismos de sobrevivência, como a produção de proteínas específicas, conhecidas como proteínas estruturadoras de gelo (ISP, por sua denominação em inglês, ice structuring proteins. Pertencem a uma classe de polipeptídeos capaz de inibir o crescimento dos cristais de gelo durante a nucleação, reduzindo assim os danos na estrutura celular desses organismos causados pela formação dos cristais. Em alimentos processados submetidos ao congelamento, o controle do crescimento dos cristais de gelo é crítico na prevenção de danos à qualidade final do produto, sendo, portanto, objeto de interesse pelas indústrias e pesquisadores do setor. Apesar de as ISP já terem sido extraídas de folhas de trigo e de outros cereais, ainda não se definiu uma metodologia de extração e purificação adequada e eficiente, objetivo pelo qual o presente estudo foi realizado. Cultivares de inverno (Ok Bullet e Endurance) e de primavera (Pioneiro) foram semeadas em potes plásticos com três repetições de cada, cresceram em condições controladas em câmara de crescimento com sistema de refrigeração, com temperaturas entre 4 e 7 ° C (plantas aclimatadas ao frio). Outras três repetições de cada cultivar foram mantidas em condições ótimas de crescimento (plantas sem aclimatação ao frio), em temperaturas de 23 à 25 ° Um pote de cada repetição, aclimatadas e não C. aclimatadas, foi retirado da câmara a cada sete dias, e suas folhas foram colhidas durante um período de 49 dias de crescimento. As folhas de cada cultivar, após liofilizadas, foram divididas em dois grupos, E1 ou E2, que se diferenciavam pelo processo de extração. Na metodologia E1, as folhas foram cortadas, trituradas com Tris-HCl (pH=7,4), centrifugadas e filtradas para obtenção do extrato. Em E2, as folhas foram trituradas com solução tampão de ácido ascórbico: cloreto de cálcio (pH=3,0) e passaram por um processo de impregnação à vácuo. Os extratos brutos obtidos por E1 e E2 foram submetidos a três processos de purificação, P1, P2 e P3. Na metodologia P1, as amostras foram tratadas com acetona, em P2 com éter etílico: éter de petróleo (1:1) e em P3, foi utilizado clorofórmio. Na metodologia P1, os extratos foram agitados em vórtex, centrifugados e o precipitado ressupendido para obtenção do extrato purificado. Em P2, foram agitados em vórtex e decantados. Em P3, os extratos foram agitados em vórtex e centrifugados. Os extratos brutos e purificados foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE). O teor de sólidos variou de 1456,00 a 1543,00 mg/100g para E1 e de 850,00 a 980,00 mg/100g, para E2 . Pela metodologia E1, os teores de proteína foram de 201,84 mg/100g, 217,71 mg/100g e 270,49 mg/100g, para as cultivares Pioneiro, Ok Bullet e Endurance, respectivamente. Para a extração E2 esses valores foram de 118,45 mg/100g, 357,96 mg/100g e 395,33 mg/100g. Os extratos obtidos por E1 e E2 apresentaram teores de cinzas de 2,0 % e 1,98 % para cultivar Pioneiro, para Ok Bullet (2,11 % e 2,07 %) e para Endurance (2,13 % e 2,10 %) respectivamente. Nos extratos de folhas aclimatadas ao frio, obtido pela extração E1 foram identificadas uma proteína na faixa de 45,0 - 66,0 kDa e outra de 30,0 - 45,0 kDa para cultivar Pioneiro. Para Ok Bullet e Endurance, além dessas, foi observada uma terceira banda de 20,1 - 30,0 kDa e outras duas, uma na faixa de 66,0 - 97,0 kDa e outra de 45,0 - 66,0 kDa. Pela extração E2 foi observada apenas uma proteína na faixa de 20,1 - 30,0 kDa para as três cultivares. Comparada aos extratos controles de E1 e E2, a metodologia de purificação P1 produziu efeito significativo (p<0,05) somente para a cultivar Pioneiro, resultando em menor teor de proteína bruta após a purificação. O procedimento P3, produziu efeito similar nas cultivares Ok Bullet e Endurance, em relação a ambos os controles. O método de purificação P2 não é indicado para nenhuma cultivar, pois reduziu o teor proteico nos extratos E1 e E2. Após a purificação para cultivar Pioneiro, foram identificadas proteínas na faixa de 20,1-30,0 kDa e de 45,0-66,0 kDa, para as cultivares Ok Bullet e Endurance. Além das duas observadas na Pioneiro, constatou-se também a presença de mais duas proteínas, uma na faixa de 66,0-97,0 kDa e outra de 45,0-66,0 kDa, as mesmas faixas visualizadas nos perfis eletroforéticos dos extratos brutos obtidos por E1. Para os géis dos extratos purificados as mesmas proteínas observadas nos extratos brutos de E2, com massa molecular de 20,1 30,0 kDa foram visualizadas. A metodologia de extração E1 foi a mais eficiente para a cultivar Pioneiro enquanto que E2 foi a melhor para as cultivares Ok Bullet e Endurance. A purificação com clorofórmio (P3) foi mais eficiente na cultivar Pioneiro, enquanto a acetona (P1) foi melhor para as cultivares OK Bullet e Endurance. O presente trabalho indica que resultados de pesquisas desenvolvidas no exterior, não são necessariamente adequados às cultivares de trigo no Brasil. Trigos nacionais são essencialmente de primavera, e demandam pesquisas específicas, visto que demonstram potencial para obtenção de ISP com características diferentes daquelas produzidas por trigos de inverno.
When certain organisms are subjected to low temperatures, they tend to develop survival mechanisms, such as the production of specific proteins, known as ice structuring proteins (ISP). These proteins belong to a class of polypeptides capable of inhibiting the growth of ice crystals during the nucleation, thereby reducing the damage to the cell structure of these organisms caused by the formation of crystals. In processed food subjected to freezing, the control of ice crystals growth is critical in preventing damage to the final product quality, and, therefore, it is an area of interest to industry researchers. In spite of ISP having already been extracted from wheat and other cereals, a methodology for appropriate and efficient extraction and purification has not been defined, which is the purpose of this study. Winter cultivars (Ok Bullet and Endurance) and spring (Pioneer) were sown in plastic pots. Three replications of each cultivar were grown in controlled conditions, in a growth chamber with cooling system, with temperatures between 4 - 7 ° (cold acclimated plants). Another three replicates C were kept under optimal growth conditions, at temperatures of 23 25 ° One pot per C. replicate was withdrawn from the chamber every seven days, and their leaves were collected for study. This process was repeated over a period of 49 days of growth, with and without acclimatization. The lyophilized leaves of each cultivar were divided into two groups and each passed through an extraction process, E1 or E2. In the E1 group, leaves were cut, ground with Tris -HCl (pH=7.4), centrifuged, and filtered to obtain a crude extract containing the proteins. E2 leaves were ground with ascorbic acid: calcium chloride (pH=3.0) and passed through an impregnation process in a vacuum for the extraction of proteins. The extracts obtained by E1 and E2 were subjected to three purification processes, P1, P2 and P3. In the P1 methodology, samples were treated with acetone, P2 with ethyl ether: petroleum ether (1:1), and in the P3 methodology chloroform was used. In the P1 methodology, extracts were stirred in vortex, centrifuged and the precipitate resuspended for obtaining purified extract. In P2 they were stirred in vortex and decanted. In P3 the extracts were stirred in vortex and centrifuged. The crude extracts were purified and analyzed by electrophoresis in SDS - PAGE. The solids content ranged from 1446.00 to 1543.00 mg/100g for E1, and for E2 the values ranged from 850.00 to 980.00 mg/100g. In the E1 group, the Pioneiro cultivar showed protein content of 201,84 mg/100 g, Ok Bullet and Endurance 217.71 and 270.49 mg/100g respectively. In the E2 group these values were 118,45, 357.96 and 395.33 mg/100g. The extracts obtained from the Pioneiro cultivar for E1 and E2 showed ash content of 2.0% and 1.98% respectively, Ok Bullet (2.11% and 2.07 %) and Endurance (2.13 % and 2.10 %). In extracts of Pioneiro wheat acclimated to cold, it was obtained by extraction methodology E1, one protein in the range from 45.0 to 66.0 kDa, and another in the range 30.0 to 45.0 kDa. For Ok Bullet and Endurance, as well as the above conditions, a third band of 20.1 30.0 kDa was observed, as well as two others, one in the range 66.0 97.0 kDa and the other in the range 30.0 45.0 kDa. For the E2 extraction methodology, only one protein range was observed from 20.1 to 30.0 kDa for the three cultivars. In gels of both extractions (E1 and E2), the presence of ISP in range from 20.1 to 30.0 kDa was observed. Compared to the control extracts from E1 and E2, the P1 purification methodology produced a significant effect only for the Pioneiro cultivar, resulting in a lower content of crude protein after purification. The P3 procedure produced similar effect in the Ok Bullet and Endurance cultivars, compared to both controls. The P2 purification method reduced the protein content for all varieties in the E1 and E2 extracts, so it is not recommended for any variety. After the process of purification for Pioneiro cultivar, a protein was identified in the range of 20.1 to 30.0 kDa and another in the range of 45.0 to 66.0 kDa. For the Ok Bullet and Endurance cultivars, in addition to the two found in the Pioneiro, the presence of two more proteins were identified, one in the range of 66.0 to 97.0 kDa and the other 45.0 to 66.0 kDa, the same ranges that were observed in the extracts electrophoretic profiles obtained from the E1 group. For the gels of the purified extracts, the same proteins observed in the crude extracts of the E2 group, with molecular mass from 20.1 to 30.0 kDa were observed. The E1 extraction methodology was the most efficient for the Pioneiro cultivar while E2 was best for the Ok Bullet and Endurance cultivars. Purification with chloroform (P3) was more effective for the Pioneiro cultivar while acetone (P1) was better for the OK Bullet and Endurance cultivars. This study indicates that research results undertaken abroad are not necessarily suited to wheat cultivars in Brazil. Brazilian wheat cultivars are essentially spring-harvested, and require specific research, whereas they demonstrate to be potential sources for obtaining ISP with different characteristics from those produced by winter-harvested wheat.
Palavras-chave: Trigo - Folhas
Gelo - Extração
Gelo - Purificação
Gelo - Estrutura - Proteína
Wheat - Leaves
Ice - Extraction
Ice - Purification
Ice - Structure - Protein
CNPq: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::CIENCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS::CIENCIA DE ALIMENTOS
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Ciência de Alimentos; Tecnologia de Alimentos; Engenharia de Alimentos
Programa: Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Citação: CAMPELO, Flávia Assunção. Extraction and purification of ice structuring proteins obtained from wheat leaves. 2014. 69 f. Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos; Tecnologia de Alimentos; Engenharia de Alimentos) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2014.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/2946
Data do documento: 27-Jun-2014
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