Produção enzimática de xilooligossacarídeos com atividade prebiótica in vitro

Abstract

Os xilooligossacarídeos (XOS) são ingredientes prebióticos potencialmente valiosos para alimentos e rações que podem ser obtidos a partir de biomassas lignocelulósicas de baixo custo e abundantes. Para a produção de XOS, a hidrólise enzimática é comumente preferida pois não produz subprodutos indesejáveis, nem requer condições especiais de temperatura e pressão. Portanto, diversas técnicas moleculares têm sido desenvolvidas para a obtenção de xilanases com maior eficiência catalítica e características ideais para a produção de XOS. Com isso, as xilanases recombinantes de Orpinomyces sp. PC-2 (SM2), estruturalmente otimizada, e Aspergillus nidulans (AN1818 e AN3613) são potenciais produtoras de XOS a partir da hidrólise de sabugo de milho, farelo de arroz, casca de soja e resíduos de café. O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil de produção de xilooligossacarídeos (XOS) via hidrólise enzimática por três enzimas fúngicas recombinantes e um coquetel comercial, individualmente, e estudar o potencial efeito prebiótico in vitro destes açúcares. Para isso, as biomassas in natura e pré- tratadas com NaOH 1 % foram caracterizadas quanto à sua composição química. Os teores de extrativos, proteínas, lipídios e cinzas foram determinados por técnicas gravimétricas e titulométricas, enquanto lignina e carboidratos por cromatografia de alta eficiência (CLAE) e espectrofotometria. A xilanase SM2 foi expressa em Escherichia coli, enquanto AN1818 e AN3613 em Pichia pastoris e empregadas na sacarificação das biomassas por 72 horas a 50 ºC. Alíquotas foram coletadas para avaliar o perfil de XOS por CLAE. Por fim, os XOS obtidos substituíram as fontes de carbonos em meios de crescimento específicos para Lactobacillus acidophilus, E. coli e Salmonella enterica serovar Typhimurium. As curvas de crescimento microbiano foram obtidas por DO em 600 nm, além da quantificação de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) por CLAE. Entre as biomassas in natura, os resíduos de café e sabugo de milho apresentaram os maiores teores de hemicelulose, 27,85 e 21,37 %, respectivamente. Já o farelo de arroz apresentou o maior teor de lignina, 36,69 %. Após pré-tratamento alcalino, as biomassas apresentaram teor de recuperação entre 46,27 e 64,99 %, com o enriquecimento de carboidratos e a redução de lignina para a posterior etapa de sacarificação. A xilanase SM2 apresentou atividade catalítica, 21853,10 (±106,73) U/mL , e rendimentos de XOS equiparáveis ao coquetel Multifect® XL em todas as biomassas testadas, além de ter sido superior as xilanases de A. nidulans (AN1818 e AN3613 com 14,37 e 20,41 U/mL, respectivamente ) na produção de XOS em cada fonte de carbono. Observou-se que, após 6 h de hidrólise do sabugo de milho, a liberação de XOS totais foram de 6,21 (±0,37) e 7,36 (±0,57) g/L, produzidos pela xilanase SM2 e pelo coquetel comercial, respectivamente. Após hidrólise do farelo de arroz, a xilanase SM2 produziu um perfil mais diversificado de XOS, com xilobiose, xilotriose, xiliopentose e xiloexose, em 48 h de reação. Além disso, o L. acidophilus foi capaz de metabolizar os XOS produzidos e fermentá-los, parâmetro indicado pela liberação de ácidos graxos de cadeia curta, como acético, propiônico e isobutírico. Já os patógenos não tiveram o crescimento favorecido na presença dos XOS como fonte de carbono. Com isso, os oligossacarídeos são fermentescíveis aos probióticos e estimulam o crescimento seletivo de bactérias benéficas. Portanto, os resultados são promissores para um teste in vivo e expandem as aplicações da xilanase SM2. Palavras-chave: Xilanases recombinantes. Xilooligossacarídeos. Prebióticos. Biomassas lignocelulósicas.

Xylooligosaccharides (XOS) are potential valuable food and feed prebiotic ingredients that can be obtained from cheap and abundant lignocellulosic biomasses. For XOS production, enzymatic hydrolysis is commonly preferred because it does not produce undesirable by- products neither requires special conditions of temperature and pressure. Therefore, several molecular techniques have been developed to obtain xylanases with greater catalytic efficiency and ideal characteristics for XOS production. Thus, recombinant xylanases from Orpinomyces sp. PC-2 (SM2) and Aspergillus nidulans (AN1818 and AN3613) are potential XOS producers after the hydrolysis of corn cob, rice bran, soybean husk and coffee residues. The aim of this study was to evaluate the production profile of xylooligosaccharides (XOS) via enzymatic hydrolysis by recombinant fungal enzymes and a commercial cocktail, and to study the potential in vitro prebiotic effect of these sugars. For this, in natura and pre-treated biomasses with NaOH 1 % were characterized concerning their chemical composition. Extractives, proteins, lipids and ash were determined by gravimetric and titrimetric techniques, while lignin and carbohydrates by high performance chromatography (HPLC) and spectrophotometry. SM2 xylanase was expressed in Escherichia coli, while the xylanases AN1818 and AN3613 were expressed in Pichia pastoris and they were employed in the saccharification of biomasses for 72 hours at 50 ºC. Aliquots were collected to determine the XOS profile by HPLC. Finally, XOS were able to substitute the carbon sources in specific growth media for Lactobaccillus acidophilus, E. coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium. Microbial growth curves were performed by OD at 600 nm, in addition to the quantification of short chain fatty acids (SCFA). Among the in natura biomasses, coffee and corn cob residues showed the highest hemicellulose contents, 27.85 and 21.37%, respectively. Rice bran had the highest lignin content, 36.69 %. After alcaline pretreatment, the biomasses showed yields between 46.27 and 64.99 %, with carbohydrate enrichment and lignin reduction for the next saccharification step. SM2 xylanase showed catalytic activity, 21853.10 (±106.73) U/mL, and XOS yields comparable to the Multifect® XL cocktail for all tested biomasses, it also was superior to A. nidulans xylanases (AN1818 and AN3613 with 14.37 and 20.41 U/mL, respectively) in the production of XOS in each carbon source. After hydrolysis of corn cob for 6 h, the total XOS yields were 6.21 (±0.37) and 7.36 (±0.57) g/L by the xylanase SM2 and the commercial xylanase, respectively. Whereas the hydrolysis of rice bran by SM2 produced a more diversified profile of XOS, like xylobiose, xylotriose, xyliopentose and xylohexose, after 48 h of reaction. Furthermore, L. acidophilus was able to metabolize the XOS produced and to fermente them, which was indicated by the release of short-chain fatty acids, such as acetic, propionic and isobutyric. On the other hand, pathogens did not have favored growth in the presence of XOS as carbon sources. Thus, oligosaccharides are fermentable by probiotics and stimulate the selective growth of beneficial bacteria. Therefore, the results are promising for an in vivo test and to expand the applications of SM2 xylanase. Keywords: Recombinant xylanases. Xylooligosaccharides. Prebiotcs. Lignocellulosic biomasses.