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Tipo: Tese
Título: Purificação parcial, propriedades e caracterização cinética de proteases tripsina-like do intestino médio da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis
Título(s) alternativo(s): Partial purification, properties and kinetics characterization of midgut trypsin-like proteases from the velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis
Autor(es): Xavier, Luciana Pereira
Primeiro Orientador: Oliveira, Maria Goreti de Almeida
Primeiro coorientador: Guedes, Raul Narciso Carvalho
Segundo coorientador: Santoro, Marcelo Matos
Primeiro avaliador: Moraes, Célia Alencar de
Segundo avaliador: Guia, Thiago Rennó dos Mares
Abstract: A identificação e caracterização de proteases do intestino médio de insetos são de grande importância para a pesquisa e desenvolvimento de cultivares resistentes às pragas agrícolas. Neste trabalho, foram realizados diferentes processos de purificação para proteases tripsina-like do intestino médio de A. gemmatalis, bem como a caracterização dessas proteases. Duas frações foram isoladas durante um dos processos de gel-filtração, a fração FI (aniônica), com atividade amidásica (substrato: L-BApNA) parcialmente purificada por troca iônica (coluna Mono-Q HR 5/5) e afinidade (coluna de p-aminobenzamidina) apresentou em SDS-PAGE bandas com massas moleculares de 17,1 kDa a 65,4 kDa; a massa molecular de 17,1k Da provavelmente seja produto de hidrólise e a massa molecular de 65,4 kDa produto de agregação; a fração FII (aniônica) também parcialmente purificada por troca aniônica e afinidade exibiu duas bandas de 33,5 kDa e 31,3 kDa. Ensaio antimicrobiano realizado contra S. aureus e E. coli indicou resultado negativo para o extrato enzimático e para amostra parcialmente purificada de FII. Em ensaio com L. monocystogenes e E. faecalis, o resultado foi positivo para o extrato enzimático e negativo para a amostra parcialmente purificada de FII. Em um segundo processo de purificação, uma serino protease tripsina-like catiônica com massa moleculare de 30 kDa (SDS-PAGE) foi purificada do intestino médio de A. gemmatalis pela combinação de cromatografia de afinidade (coluna de p-aminobenzamidina), cromatografia de troca catiônica (coluna Mono-S HR 5/5), em sistema de FPLC e cromatografia de fase reversa (coluna de C-18), em sistema de HPLC. A amostra catiônica parcialmente purificada por afinidade apresentou em SDS-PAGE, bandas com massas moleculares de 24,8 kDa, 26,3 kDa, 30 kDa, 33,4 kDa. A análise com PMSF, TLCK e TPCK, em SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina, indicou que as eszimas são serino proteases tripsina-like. Em teste de glicosilação, verificou-se que as proteases de 24,8 kDa e de 26,3 kDa são glicosiladas. A atividade específica encontrada foi de 13,2 μM.s-1.μg-1 e o fator de purificação, de 123,4 vezes. Na determinação cinética, o valor de KM app encontrado para as tripsinas-like catiônicas após cromatografia de troca iônica foi de 0,46 mM. Em análise por espectrometria de massa do material purificado em cromatografia de fase reversa em HPLC, detectaram-se as massas de 1.750,8 Da (ESI-TOF), 7.997,23 Da (MALDI-TOF) e 23.324,74 Da (ESI-TOF), sugerindo a degradação deste material durante o processamento
The identification and characterization of proteases from the insect midgut are of great importance for research and development pest resistant cultivars of crop species. Different processes of trypsin-like proteases purification from midgut A. gemmatalis and characterization of these proteases were carried out in this work. Two fractions were isolated during one of the gel-filtration processes, fraction FI (anionic), with amidasic activity (substrate: L-BApNA) partially purified by ion-exchange (Mono-Q HR 5/5 column) and affinity (p-aminebenzamidine column) showed in SDS-PAGE bands with molecular weight of 17.1 kDa and 65.4 kDa; the molecular weight of 17.1 kDa is probably hydrolysis product and the molecular weight of 65.4 kDa aggregation product. The fraction FII (anionic) also partially purified by anionic exchange and affinity presented two bands of 33.5 kDa and 31.3 kDa. Antimicrobial assay carried out against S. aureus and E. coli showed negative result for the enzymatic extract and for a partially purified sample of FII. In assay with L. monocystogenes and E. faecalis, the result was positive for the enzymatic extract and negative for a partially purified sample of FII. In a second purification process, a cationic trypsin-like serine protease with molecular weight of 30 kDa (SDS-PAGE) was purified from midgut A. gemmatalis by combining affinity chromatography (p-aminebenzamidine column), cationexchange chromatography (Mono-S HR 5/5 column), in FPLC system and reverse-phase chromatography (C-18 column), in HPLC system. The cationic sample partially purified by affinity showed in SDS-PAGE, bands with molecular weight of 24.8 kDa, 26.3 kDa, 30 kDa, and 33.4 kDa. The analysis with PMSF, TLCK, and TPCK, in SDS-PAGE co-polymerized with gelatin, indicated that the enzymes are trypsin-like serine protease. Glycosylation assay, in SDS-PAGE, showed positive results for bands of 24.8 kDa and 26.3 kDa. The specific activity found was 13.2 μM.s-1.μg-1 and the purification factor, 123.4 times. In the kinetic determination, the value of KM app found for the cationic trypsin-like after ion-exchange chromatography was 0.46 mM. Mass spectrometry analysis of the material purified by HPLC reverse phase chromatography, afforded the mass of 1750.8 Da (ESI-TOF), 7997.23 Da (MALDI-TOF) and 23324.74 Da (ESI-TOF), suggesting degradation of this material during processing
Palavras-chave: Anticarsia gemmatalis
Interação inseto-planta
Serino-proteases
Tripsina-like
Anticarsia gemmatalis
Interaction insect-plant
Serine protease
Trypsin-like
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal
Programa: Doutorado em Bioquímica Agrícola
Citação: XAVIER, Luciana Pereira. Partial purification, properties and kinetics characterization of midgut trypsin-like proteases from the velvetbean caterpillar, Anticarsia gemmatalis. 2006. 127 f. Tese (Doutorado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2006.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/304
Data do documento: 31-Ago-2006
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