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Tipo: Tese
Título: Complexo celulolítico e hemicelulolítico do fungo endofítico Fusarium verticillioides e sua aplicação para sacarificação do bagaço de cana.
Título(s) alternativo(s): Cellulolytic and hemicellulolytic complex from the endophytic fungus Fusarium verticillioides and its application on sugarcane bagasse saccharification
Autor(es): Almeida, Maíra Nicolau de
Primeiro Orientador: Rezende, Sebastião Tavares de
Primeiro coorientador: Guimarães, Valéria Monteze
Segundo coorientador: Pereira, Olinto Liparini
Primeiro avaliador: Fietto, Luciano Gomes
Segundo avaliador: Nagem, Ronaldo Alves Pinto
Terceiro avaliador: Araujo, Elza Fernandes de
Abstract: Neste trabalho o fungo endofítico Fusarium verticillioides foi avaliado quanto ao seu potencial para produção de enzimas celulases e hemicelulases visando sua aplicação no processo de sacarificação da biomassa para produção de etanol. O meio de cultivo utilizado para produção de celulases e xilanase por F. verticillioides foi otimizado. Níveis ótimos de fonte de carbono (palha de milho), fonte de nitrogênio (nitrato de sódio) e tempo de cultivo foram determinados. As atividades de endoglicanase e xilanase aumentaram de 2,8 U/mL para 8,0 U/mL e de 3,4 U/mL para 114,0 U/mL, respectivamente. Temperatura e pH ótimos foram determinados para endoglicanse (5,6; 80 °C), celobiase (5,6; 60 °C), FPase (6,0; 55 °C) e xilanase (7,0; 50 °C). O extrato enzimático otimizado foi usado na sacarificação e fermentação simultâneas de bagaço de cana. Neste processo 9,7 g/L de etanol foram obtidos com um rendimento de etanol/ biomassa (g/g) de 0,19. Um segundo meio de cultivo contendo diferentes fontes de nitrogênio (ureia, extrato de levedura, peptona e sulfato de amônio) e forrageira como fonte de carbono foi estabelecido por meio de delineamento de Plackett Burman para produção de celulases. Dois meios contrastantes, M1 e M2, foram definidos para maior produção de endoglicanase e celobiase, respectivamente. Misturas destes dois extratos foram testadas para a sacarificação do bagaço de cana e o extrato M1 apresentou o maior rendimento para conversão de glicanas 26,6 %, e de xilanases 40,4 %. Dosagens diferentes de proteína (10 mg/g, 20 mg/g e 40 mg/g de biomassa seca) do extrato M1 foram avaliadas em relação à sacarificação de bagaço de cana. Rendimentos de 43,4 % e 73,1 % foram observados para conversão de glicanas e xilanas, respectivamente quando 40 mg/g foi utilizado. Adsorção de proteína foi observada durante a sacarificação o que pode explicar a observada diminuição da produtividade durante o processo de sacarificação. O fungo F. verticillioides e o fungo Acremonium zeae foram avaliados em relação as suas capacidades de fermentação de açúcares simples e de biomassa lignocelulósica. Fusarium verticillioides produziu etanol a partir de glicose, xilose e de uma mistura dos destes dois açúcares com rendimentos de 0,47 g/g, 0,46 g/g e 0,50 g/g de etanol por açúcar utilizado. O fungo Acremonium zeae produziu etanol a partir de glicose, xilose e da mistura com rendimento de 0,37 g/g, 0,39 g/g e 0,48 g/g de açúcar utilizado. Os dois fungos foram capazes de co-fermentar glicose e xilose. Fusarium verticillioides e A. zeae produziram altas atividades de endoglicanase e de xilanase utilizando bagaço de cana como fonte de carbono. A produção de etanol a partir de 40 g/L de bagaço de cana foi de 4,6 g/L e 3,9 g/L para F. verticillioides e A. zeae, respectivamente. Grande interesse foi gerado pelas características bioquímicas da atividade de endoglicanase, como atividade em temperaturas elevadas e estabilidade em diversos pHs. Assim, foi desenvolvido um estudo de purificação e caracterização da atividade de endoglicanase do fungo F. verticillioides. Um complexo multienzimático, E1C, e uma endoglicanase livre, E2, foram purificados. O complexo E1C contém duas endoglicanases (GH3 e GH10), uma celobiohidrolase (GH7) e uma xilanase (GH10). A temperatura de máxima atividade foi 80 °C para E1C e para E2. A enzima livre e o complexo foram termoestáveis a 50 °C e 60 °C. A energia de ativação para E1C e E2 foram 21,3 KJ/mol e 27,5 KJ/mol, respectivamente. Atividade máxima de E1C foi em pH 4,5 e de E2 foi em pH 5,5; E1C apresentou alta estabilidade após 24 h de préincubação em pHs variando de 2,6 a 8,0. O valor de KM para E1C foi 10,25 g/L enquanto para E2 foi 6,58 g/L usando carboximetilcelulose como substrato. Tanto E1C quanto E2 foram significativamente ativadas por Mn2+, CoCl2, furfural, hidroximetilfurfural and ditiotreitol enquanto foram inibidas por SDS, CuSO4, FeCl3, AgNO4, ZnSO4 e HgCl2. O complexo E1C e a enzima livre E2 apresentaram atividade mais alta utilizando o substrato glicana de cevada (Barley-β-glucan) do que utilizando o substrato padrão carboxymetilcelulose (CMC), indicando atividade de endo-β-1,3-1,4-glicanase. As enzimas foram capazes de hidrolisar celopentaose, celotetraose e celotriose, entretanto com modos de ação diferentes. Em todos os ensaios que avaliavam estabilidade e eficiência, E1C apresentou melhores resultados do que E2, o que sugere vantagens geradas pela interação física de proteínas presente nos complexos.
In this work, the endophytic fungus Fusarium verticillioides was evaluated in relation to its potential to produce cellulases and hemicellulases aiming to its application on biomass saccharification for ethanol production. The culture medium used for cellulase and xylanase production was optimized. Optimum levels of carbon source concentration (corn straw), nitrogen source concentration (sodium nitrate) and time of cultivation were obtained. Endoglucanase and xylanase activities increased from 2.8 U/mL to 8.0 U/mL and from 3.4 U/mL to 114.0 U/mL, respectively. The optimal pH and temperature were determined for endoglucanase (5.6, 80 °C), cellobiase (5.6, 60 °C), FPase (6.0, 55 °C) and xylanase (7.0, 50 °C). The optimized crude extract was applied in saccharification and fermentation of sugarcane bagasse from which 9.7 g/L of ethanol was produced at an ethanol/biomass (g/g) yield of 0.19. A second cultivation medium containing different nitrogen sources (urea, yeast extract, peptone and ammonium sulfate) and forage as carbon source was established throught Plackett Burman design for cellulases production. Two contrasting media, M1 and M2 were defined for higher endoglucanase and cellobiase production, respectively. Mixtures of these two extracts were tested on a sugarcane bagasse saccharification and extract M1 presented the best performance, yielding 26.6 % of glucan conversion and 40.4 % of xylan conversion. Different dosages of protein (10 mg/g, 20 mg/g and 40 mg/g of dry biomass) were tested intending to improve the hydrolysis performance of M1 extract. Saccharification rates of 43.4 % and 73.1 % were observed for glucan and xylan fractions respectively when 40 mg/g was used. A high protein adsorption on substrate was observed during saccharification assays employing M1 extract and that can explain de lower sugar productivity in the saccharification process along the time. The fungus F. verticillioides and the fungus Acremonium zeae were evaluated in relation to its abilities to ferment simple sugars and lignocellulosic biomass. The fungus Fusarium verticillioides produced ethanol from glucose, xylose and a mixture of these two sugars in limited oxygen conditions with yields of 0.47 g/g, 0.46 g/g and 0.50 g/g of ethanol per sugar utilized. The fungus Acremonium zeae produced ethanol from glucose, xylose and mixture of these two sugars with yields of 0.37 g/g, 0.39 g/g and 0.48 g/g of ethanol per sugar utilized. Both fungi were able to co-ferment glucose and xylose. Fusarium verticillioides and A. zeae produced high endoglucanase and xylanase activities using sugarcane bagasse as substrate. Ethanol production from 40 g/L of pre-treated sugarcane bagasse was 4.6 g/L and 3.9 g/L for Fusarium verticillioides and A. zeae, respectively. Both fungi showed features suitable for consolidated bioprocessing. Great interest was generated by the biochemical characteristics of the endoglucanase activity, as activity in high temperatures and stability in various pHs. Then it was developed a purification and characterization study of endoglucanase activity from the fungus F. verticillioides. A multienzyme complex, E1C, and a free endoglucanase, E2 were purified. The E1C contained two endoglucanases (GH6 and GH10), one cellobiohydrolase (GH7) and one xylanase (GH10). The temperature of maximal activity was 80 °C for both E1C and E2. The free enzyme and the complex were very thermostable at 50 °C and 60 °C. The activation energies for E1C and E2 were 21.3 KJ/mol and 27.5 KJ/mol, respectively. Maximum activity of E1C was encountered at pH 4.5 and of E2 was at pH 5.5; E1C presented high stability after 24 h of pre-incubation at pH ranging from 2.6 to 8.0. The KM value for E1C was 10.25 g/L while for E2 was 6.58 g/L using carboxymethylcellulose as substrate. Both E1C and E2 were significantly activated by Mn2+, CoCl2, furfural, hydroxymethylfurfural and dithiothreitol while they were inhibited by SDS, CuSO4, FeCl3, AgNO4, ZnSO4 and HgCl2. Both E1C and E2 presented higher activity towards barley-β-glucan than carboxymethylcellulose (CMC), indicating endo-β-1,3-1,4-glucanase activity. The enzymes were able to hydrolyze cellopentaose, cellotetraose and cellotriose, however, in different mode of action. In all the assays evaluating stability and efficiency E1C showed better performance than E2, suggesting advantages generated by the physical interaction between proteins.
Palavras-chave: Celulase
Hemicelulase
Fusarium verticillioides
Cellulase
Hemicellulase
Fusarium verticillioides
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::ENZIMOLOGIA
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal
Programa: Doutorado em Bioquímica Agrícola
Citação: ALMEIDA, Maíra Nicolau de. Cellulolytic and hemicellulolytic complex from the endophytic fungus Fusarium verticillioides and its application on sugarcane bagasse saccharification. 2013. 143 f. Tese (Doutorado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2013.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/321
Data do documento: 22-Fev-2013
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