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Tipo: Tese
Título: Expressão heteróloga e caracterização bioquímica da proteína recombinante GmSBP2/S64 da soja (Glycine max)
Título(s) alternativo(s): Heterologous expression and biochemical characterization of GmSBP2/S64 recombinant protein from soybean (Glycine max)
Autor(es): Luz, Dirce Ferreira
Primeiro Orientador: Fontes, Elizabeth Pacheco Batista
Primeiro coorientador: Pereira, Maria Cristina Baracat
Segundo coorientador: Oliveira, Marli Lourdes de
Primeiro avaliador: Rezende, Sebastião Tavares de
Segundo avaliador: Martín, Francisco Javier Medrano
Abstract: A proteína de ligação à sacarose (SBP) pertence à família das proteínas cupim e é relacionada estruturalmente às proteínas de armazenamento do tipo vicilinas. Nesta investigação, a SBP foi expressa em E. coli e grandes quantidades da proteína foi acumulada na fração insolúvel como agregados, proteína desnaturada. A renaturação da proteína purificada se deu com a remoção progressiva da uréia no tampão de renaturação, que continha um sistema de retirada de óxido (2 mM de glutationa reduzida e 0,2 mM de glutationa oxidada) e glicerol 5% (v/v) como um agente estabilizador de proteína. A renaturação da proteína foi monitorada usando o dicroísmo circular na faixa do UV distante (CD), a fluorescência intrínseca, e o apagamento por acrilamida, KCl e KI. A porcentagem da estrutura secundária da proteína renaturada, que foi calculada com base no espectro de CD, foi consistente com aquela obtida pelo modelamento teórico com grande predominância da estrutura de beta barril (42%) sobre a alfa-hélice (9,9%). O máximo da emissão de fluorescência de 303 nm para a SBP indicou que o triptofano fluorescente foi completamente internalizado dentro de um ambiente altamente hidrofóbico. Não obstante, o apagamento do triptofano pela acrilamida, KI e CsCL e respectiva constante de Stern-Volmer (Ksv) de 23,5 +- 0,5 M-1, 16,1 +- 0,2 M-1 e 4,9 +- 0,1 M-1 indicam que os resíduos de triptofano fluorescentes foram bastante acessíveis aos apagadores e, conseqüentemente, expostos ao solvente. Foi medida também a constante de dissociação de equilíbrio (Kd) da ligação da sacarose por titulação da fluorescência usando a proteína renaturada. A baixa afinidade de ligação da sacarose (Kd = 2,79 +- 0,22 mM) à proteína renaturada foi similar àquela da proteína nativa purificada das sementes de soja. Coletivamente, os resultados apontam que a estrutura enovelada da proteína renaturada é similar à proteína SBP nativa. Como um membro da família das proteínas bicupim que incluem proteínas de armazenamento de semente altamente estáveis, foi de interesse determinar a estabilidade estrutural da SBP. As desnaturações térmicas e químicas da proteína foram examinadas por monitoramento das mudanças nos espectros de CD e na fluorescência intrínseca da proteína renaturada. Os resultados indicam que a SBP permaneceu enovelada em uma extensão similar na presença ou ausência de 8 M de uréia ou de 6 M de GdnHCl. Do mesmo modo, foi razoavelmente estável em altas temperaturas. A alta estabilidade da proteína renaturada pode ser uma propriedade remanescente da SBP de seu parentesco evolucionário com as proteínas de armazenamento de sementes.
The sucrose binding protein (SBP) belongs to the cupin family of proteins and is structurally related to vicilin-like storage proteins. In this investigation, SBP was expressed in E. coli and large amounts of the protein accumulated in the insoluble fraction as aggregated, denatured protein. The refolding of the purified protein proceeded with a progressive removal of urea into the renaturation buffer, which contained an oxido shuffling system (2 mM reduced glutathione and 0.2 mM oxidized glutathione) and glycerol 5% (v/v) as a proteinstabilizing agent. The renaturation of the protein was assayed by using far-UV circular dichroism (CD), intrinsic fluorescence, and quenching by acrylamide, KCl and KI. The percentage of secondary structure of the renatured protein, which was calculated on the basis of the CD spectrum, was consistent with that obtained by theoretical modeling with a large predominance of beta-strand structure (42%) over the alfa-helix (9.9%). The fluorescence emission maximum of 303 nm for SBP indicated that the fluorescent tryptophan was completely buried within a highly hydrophobic environment. Nevertheless, tryptophan quenching by acrylamide, KI and CsCL and the respective Stem-Volmer (Ksv) constant of 23.5 +- 0.5 M-1, 16.1 +- 0.2 M-1 and 4.9 +- 0.1 M-1 indicate that the fluorescent tryptophan residues were quite accessible to the quenchers and hence exposed to the solvent. We also measured the equilibrium dissociation constant (Kd) of sucrose binding by fluorescence titration using the refolded protein. The low sucrose binding affinity (Kd = 2.79 +- 0.22 mM) of the renatured protein was similar to that of the native protein purified from soybean seeds. Collectively, our results indicate that the folded structure of the renatured protein is similar to the native SBP protein. As a member of the bicupin family of proteins which include highly stable seed storage proteins, it was of interest to determine the structural stability of SBP. The thermal and chemical denaturations of the protein were examined by monitoring changes in the CD spectra and in the intrinsic fluorescence of the renatured protein. Our results indicate that SBP remained folded to a similar extent in the presence or absence of 8 M urea or 6 M GdnHCl. Likewise, it was fairly stable to high temperatures. The high stability of the renatured protein may be a eminiscent property of SBP from its evolutionary relatedness to the seed storage proteins.
Palavras-chave: Proteína recombinante
Dicroísmo circular
Fluorescência
Recombinant protein
Circular dichroism
Fluorescence
CNPq: CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOQUIMICA::BIOLOGIA MOLECULAR
Idioma: por
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal
Programa: Doutorado em Bioquímica Agrícola
Citação: LUZ, Dirce Ferreira. Heterologous expression and biochemical characterization of GmSBP2/S64 recombinant protein from soybean (Glycine max). 2006. 87 f. Tese (Doutorado em Bioquímica e Biologia molecular de plantas; Bioquímica e Biologia molecular animal) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2006.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/333
Data do documento: 9-Jun-2006
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