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Tipo: Tese
Título: Genotypic and phenotypic characterization of Lactobacillus gasseri isolated from a newborn infant
Título(s) alternativo(s): Caracterização genotípica e fenotípica de Lactobacillus gasseri isolatedos de recém nascidos
Autor(es): Cunha, Luciana Rodrigues da
Primeiro Orientador: Ferreira, Célia Lúcia de Luces Fortes
Primeiro coorientador: Pinto, Cláudia Lúcia de Oliveira
Segundo coorientador: Stringheta, Paulo César
Primeiro avaliador: Neumann, Elisabeth
Segundo avaliador: Alvarenga, Marcelo Bonnet
Resumo: The objective of this study was to characterize Lactobacillus gasseri strains isolated from a healthy newborn infant for potential use as a probiotic in human milk banks in Brazil. This study was divided into three phases. The first examines the genotypic (identification at the species level and evaluation of genetic diversity among the isolates) and phenotypic characterization of the strains with regard to safety and functional properties currently recommended by FAO/WHO for validation of new probiotic strains. Thirty strains were isolated from breast fed newborn stools and were evaluated for resistance to antibiotics, hemolytic activity, bile tolerance, antagonism toward selected Gram-positive and Gram-negative pathogens and presence of plasmids. Based on the results from PFGE, antibiotic resistance and plasmid profiles, three strains (NCK2140, 2141 and 2142) were selected and evaluated for resistance to small intestine and gastric juices, ability to adhere to mucin, fibronectin, Caco-2 and HT-29 cell lines. In the second phase, the four plasmids identified in the strain NCK2141 were sequenced by the shotgun sequencing technique and were annotated by GAMOLA® software. The resulting genes and CDS designations were viewed using Artemis® software. BLAST was carried out for each designated gene to confirm and to refine the in silico annotations. In the third phase, the ability of the selected strains to adhere to fibronectin binding protein and the effect of growth conditions on the adhesion were examined. It was also investigated the functional role of this protein in the adhesion and stress response of the cell. In this study, all thirty isolates were identified as Lactobacillus gasseri through 16S rDNA sequencing. Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) using restriction enzymes Sma I and Apa I revealed that 29 of the L. gasseri were identical; one isolate (NCK2142) was closely related, but exhibited a distinctive DNA fingerprint. All 30 strains harbored 3 plasmids, with one strain (NCK2141) that showed strong tolerance to 0.5% of bile and harbored a unique fourth plasmid encoding a putative multidrug resistance transporter protein (lmrB). No hemolytic activity or antagonism, beyond acid inhibition was observed. The three selected strains NCK2140, 2141 and 2142 showed strong resistance to small intestinal and gastric juices, and adhered in vitro to mucin, fibronectin and two intestinal epithelial cell lines, Caco-2 and HT-29. The complete nucleotide sequence of the plasmids (pTRK1023, 1024, 1025, and 1026) revealed that they are circular and contain 36, 7, 20 and 46 open reading frames, respectively. All four plasmids are predicted to replicate by the theta mechanism, and have G+C contents consistent with those found in other lactobacilli strains (37-40%), with the exception of pTRK1025 (44.57%). The plasmids appear to encode functional properties, such as collagen binding (pTRK1026), lantibiotic biosynthesis (pTRK1023) and carbohydrate transport (pTRK1023 and pTRK1026) that may provide competitive advantages to the plasmid- carrying cells. Cell maintenance mechanisms (partitioning and TA system) were also observed, thus explaining the failure to cure these plasmids. Plasmid pTRK1024 harbored a putative lmrB gene, an ATP-binding cassette-type multidrug resistance transporter protein, which has been associated with clindamycin and lincomycin resistance. Cloning experiments did not correlate the erythromycin, cephalothin and oxacillin resistance of NCK2141 to LmrB. However, for safety reasons, strain NCK2141 should not be used as a probiotic. Significantly higher adherence to fibronectin was observed when the strains NCK2140, 2141 and 2142 were grown on MRS agar under anaerobic condition. It was also observed a reduction of in vitro adherence of fbp mutants (NCK2147 and NCK2148) to immobilized fibronectin and HT-29 intestinal epithelial cells. The inactivation of the fbp locus did not influence the gastric juice susceptibility of the mutant strains.
Abstract: O objetivo deste estudo foi caracterizar novas estirpes de Lactobacillus gasseri isoladas de recém-nascidos saudáveis para potencial uso como probiótico em bancos de leite humano no Brasil. Este estudo foi dividido em três fases. Na primeira, realizou-se a caracterização genotípica das estirpes com a identificação dos isolados ao nivel de espécie e avaliação da diversidade genética entre eles). Caracterização fenotípica também foi realizada considerando os aspectos funcionais e de segurança recomendados pela FAO/OMS para a validação de novas culturas probióticas. Avaliou-se trinta estirpes isoladas de fezes de recém-nascidos quanto à resistência a antibióticos, atividade hemolítica, tolerância a sais biliares, presença de plasmídeos e antagonismo a patógenos Gram-positivos e Gram-negativos. Com base na diversidade genética (PFGE), resistência a antibióticos e perfil plasmidial, três estirpes (NCK2140, 2141 e 2142) foram selecionadas e avaliadas quanto à resistência ao suco gástrico e pancreático, capacidade de adesão à mucina, fibronectina, e às linhagens de células intestinais humanas, Caco-2 e HT-29. Na segunda fase, os quatro plasmídeos identificados na estirpe NCK2141 foram sequenciados pela técnica de shotgun, anotados por meio do GAMOLA® software e os genes resultantes foram identificados por meio do software Artemis®. Posteriormente, análises BLAST foram realizadas para confirmar as anotações in silico. Na terceira fase, avaliou-se a capacidade das estirpes selecionadas aderirem à fibronectina imobilizada e a influência dessa proteina sobre as caracteristicas probióticas da célula como, resposta ao estresse digestivo e habilidade de adesão. Os trinta isolados foram identificados como Lactobacillus gasseri por meio do sequenciamento do 16S rDNA, e vinte nove deles foram idênticos pela técnica de Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE) utilizando-se as enzimas de restrição Sma I e Apa I. O isolado NCK2142 apresentou-se estritamente relacionado aos outros, diferindo-se apenas por uma única banda no gel. Todas as 30 estirpes não apresentaram atividade hemolítica e carreavam três plasmídeos, exceto a estirpe NCK2141, que apresentou um quarto plasmídeo, codificando um sistema de transporte que confere resistência à múltiplas drogas (lmrB). Essa mesma estirpe mostrou maior tolerância a bile (0.5%) e resistência a eritromicina, cefalotina e oxacilina. Todas as estirpes apresentaram antagonismo frente aos patógenos avaliados sendo a inibição assossiada apenas à produção de ácidos orgânicos. Os três isolados selecionados NCK2140, 2141 e 2142 foram resistentes ao suco gástrico e ao suco pancreático e apresentaram boa capacidade de adesão in vitro a mucina, fibronectina e às linhagens de células humanas do câncer de cólon, Caco-2 e HT-29. Os quatro plasmídeos identificados, pTRK1023, 1024, 1025 e 1026 apresentaram morfologia circular, replicação por mecanismo teta e 36, 7, 20 e 46 open reading frames (ORF), respectivamente. Os conteúdos de G+C foram consistentes com aqueles encontrados em outras estirpes de Lactobacillus (37 - 40%), exceto o pTRK1025 que foi de 44,57%. Algumas propriedades funcionais como, proteínas de ligação ao colágeno (pTRK1026), biossíntese de lantibióticos (pTRK1023) e transporte de carboidratos (pTRK1023 e pTRK1026) foram identificados nos plasmídeos, as quais podem promover vantagens competitivas para as células hospedeiras. Mecanismo de manutenção celular como, Sistema de Separação e Toxina-Antitoxina também foi observado, explicando a dificuldade de cura dos plasmídeos. O gene lmrB identificado no pTRK1024, é associado à resistência a alguns antibióticos, no entanto, o experimento de clonagem não confirmou a relação do mesmo com a maior resistencia à eritromicina, cefalotina e oxacilina apresentada pelo isolado NCK2141 carreador desse plasmideo. Por questões de segurança, essa estirpe não pode ser utilizada como um probiótico. Maior adesão in vitro foi observada à fibronectina quando as estirpes NCK2140, 2141 e 2142 foram cultivadas em ágar MRS e incubadas em condições de anaerobiose. Observou-se também que os mutantes fbp (NCK2147 e NCK2148) tiveram menor aderência à fibronectina imobilizada e à linhagem celular humana HT-29. A inativação do gene fbp não influenciou a susceptibilidade das estirpes recombinates ao suco gástrico.
Palavras-chave: Probiotics
Security parameters
Bifid bacteria
Probióticos
Parâmetros de segurança
Bactérias bífidas
CNPq: CNPQ::CIENCIAS AGRARIAS::CIENCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS::CIENCIA DE ALIMENTOS
Idioma: eng
País: BR
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Sigla da Instituição: UFV
Departamento: Ciência de Alimentos; Tecnologia de Alimentos; Engenharia de Alimentos
Programa: Doutorado em Ciência e Tecnologia de Alimentos
Citação: CUNHA, Luciana Rodrigues da. Caracterização genotípica e fenotípica de Lactobacillus gasseri isolatedos de recém nascidos. 2011. 164 f. Tese (Doutorado em Ciência de Alimentos; Tecnologia de Alimentos; Engenharia de Alimentos) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, 2011.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://locus.ufv.br/handle/123456789/438
Data do documento: 18-Mar-2011
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