Genotypic and phenotypic characterization of Lactobacillus gasseri isolated from a newborn infant

Abstract

O objetivo deste estudo foi caracterizar novas estirpes de Lactobacillus gasseri isoladas de recém-nascidos saudáveis para potencial uso como probiótico em bancos de leite humano no Brasil. Este estudo foi dividido em três fases. Na primeira, realizou-se a caracterização genotípica das estirpes com a identificação dos isolados ao nivel de espécie e avaliação da diversidade genética entre eles). Caracterização fenotípica também foi realizada considerando os aspectos funcionais e de segurança recomendados pela FAO/OMS para a validação de novas culturas probióticas. Avaliou-se trinta estirpes isoladas de fezes de recém-nascidos quanto à resistência a antibióticos, atividade hemolítica, tolerância a sais biliares, presença de plasmídeos e antagonismo a patógenos Gram-positivos e Gram-negativos. Com base na diversidade genética (PFGE), resistência a antibióticos e perfil plasmidial, três estirpes (NCK2140, 2141 e 2142) foram selecionadas e avaliadas quanto à resistência ao suco gástrico e pancreático, capacidade de adesão à mucina, fibronectina, e às linhagens de células intestinais humanas, Caco-2 e HT-29. Na segunda fase, os quatro plasmídeos identificados na estirpe NCK2141 foram sequenciados pela técnica de shotgun, anotados por meio do GAMOLA® software e os genes resultantes foram identificados por meio do software Artemis®. Posteriormente, análises BLAST foram realizadas para confirmar as anotações in silico. Na terceira fase, avaliou-se a capacidade das estirpes selecionadas aderirem à fibronectina imobilizada e a influência dessa proteina sobre as caracteristicas probióticas da célula como, resposta ao estresse digestivo e habilidade de adesão. Os trinta isolados foram identificados como Lactobacillus gasseri por meio do sequenciamento do 16S rDNA, e vinte nove deles foram idênticos pela técnica de Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE) utilizando-se as enzimas de restrição Sma I e Apa I. O isolado NCK2142 apresentou-se estritamente relacionado aos outros, diferindo-se apenas por uma única banda no gel. Todas as 30 estirpes não apresentaram atividade hemolítica e carreavam três plasmídeos, exceto a estirpe NCK2141, que apresentou um quarto plasmídeo, codificando um sistema de transporte que confere resistência à múltiplas drogas (lmrB). Essa mesma estirpe mostrou maior tolerância a bile (0.5%) e resistência a eritromicina, cefalotina e oxacilina. Todas as estirpes apresentaram antagonismo frente aos patógenos avaliados sendo a inibição assossiada apenas à produção de ácidos orgânicos. Os três isolados selecionados NCK2140, 2141 e 2142 foram resistentes ao suco gástrico e ao suco pancreático e apresentaram boa capacidade de adesão in vitro a mucina, fibronectina e às linhagens de células humanas do câncer de cólon, Caco-2 e HT-29. Os quatro plasmídeos identificados, pTRK1023, 1024, 1025 e 1026 apresentaram morfologia circular, replicação por mecanismo teta e 36, 7, 20 e 46 open reading frames (ORF), respectivamente. Os conteúdos de G+C foram consistentes com aqueles encontrados em outras estirpes de Lactobacillus (37 - 40%), exceto o pTRK1025 que foi de 44,57%. Algumas propriedades funcionais como, proteínas de ligação ao colágeno (pTRK1026), biossíntese de lantibióticos (pTRK1023) e transporte de carboidratos (pTRK1023 e pTRK1026) foram identificados nos plasmídeos, as quais podem promover vantagens competitivas para as células hospedeiras. Mecanismo de manutenção celular como, Sistema de Separação e Toxina-Antitoxina também foi observado, explicando a dificuldade de cura dos plasmídeos. O gene lmrB identificado no pTRK1024, é associado à resistência a alguns antibióticos, no entanto, o experimento de clonagem não confirmou a relação do mesmo com a maior resistencia à eritromicina, cefalotina e oxacilina apresentada pelo isolado NCK2141 carreador desse plasmideo. Por questões de segurança, essa estirpe não pode ser utilizada como um probiótico. Maior adesão in vitro foi observada à fibronectina quando as estirpes NCK2140, 2141 e 2142 foram cultivadas em ágar MRS e incubadas em condições de anaerobiose. Observou-se também que os mutantes fbp (NCK2147 e NCK2148) tiveram menor aderência à fibronectina imobilizada e à linhagem celular humana HT-29. A inativação do gene fbp não influenciou a susceptibilidade das estirpes recombinates ao suco gástrico.