Expressão, purificação e caracterização da proteína capsidial de Cowpea mild mottle virus e suas aplicações na detecção viral

Abstract

O Cowpea mild mottle virus (CpMMV), agente causal da necrose da haste, tem chamado a atenção dos produtores de soja nos últimos anos devido às perdas de produtividade geradas nas principais regiões produtoras do Brasil. A doença foi relatada pela primeira vez na região Centro-Oeste do Brasil, na safra de 2000/01, e rapidamente se espalhou por todo o país nos anos seguintes. Além disso, tem sido relatada a ocorrência de cultivares de soja assintomáticas, o que dificulta a seleção de genótipos para programas de melhoramento. Os métodos sorológicos para a detecção viral requerem o uso de um antissoro de boa qualidade para alcançar especificidade e sensibilidade. A sequência completa da capa proteica de um isolado brasileiro de CpMMV (Bahia) foi clonado em um vetor de expressão bacteriano e transformado em Escherichia coli BL21: DE3 para expressão in vitro. A proteína capsidial ligada a uma cauda de histidina foi purificada sob condições desnaturantes através de cromatografia de afinidade, utilizando uma resina Ni-NTA. Depois da renaturação, a integridade e a identidade da proteína recombinante purificada foi confirmada por SDS-PAGE e análise de espectrometria de massa (MALDI-ToF/ToF). Dois coelhos da raça Nova Zelândia foram imunizados com quantidades crescentes da proteína recombinante. A especificidade e sensibilidade do antissoro foram avaliadas por Western blot e ELISA indireto. O antissoro policlonal a partir da proteína recombinante da capa proteica provou ser uma ferramenta confiável e eficiente para a detecção CpMMV.

Cowpea mild mottle virus (CpMMV), the causal agent of stem necrosis disease, has drawn attention of soybean producers in recent years due to productivity losses in the main producing regions of Brazil. The disease was first recorded in the Midwest region of Brazil in the 2000/01 soybean season and rapidly spread throughout the country in the following years. CpMMV is usually hard to diagnose due to its wide range of symptoms while the occurrence of asymptomatic soybean cultivars complicates genotypic selection in breeding programs. Serological methods for viral detection require the use of an antiserum of good quality to achieve specificity and sensitivity. The entire coat protein sequence of a Brazilian CpMMV isolate was cloned into a bacterial expression vector and transformed into Escherichia coli BL21::DE3 for in vitro expression. The coat protein, fused to a 6 His-tag, was purified under denaturing conditions by affinity chromatography using a Ni-NTA resin. After renaturation, the integrity and identity of purified recombinant protein was confirmed by SDS-Page and MALDI-ToF/Tof mass spectrometer analyses. New Zealand rabbits were immunized with increasing amounts of the recombinant protein. The specificity and sensitivity of the antisera was shown by Western blot and indirect ELISA assays. The polyclonal antisera raised against recombinant coat protein proved to be a reliable tool for CpMMV detection.