Desenvolvimento e validação de marcadores microssatélites para o feijão-comum

Abstract

O feijão-comum (Phaseolus vulgaris L.) é uma cultura de destacada importância nutricional, econômica e social. Programas de melhoramento genético do feijoeiro têm utilizado marcadores moleculares como importantes ferramentas auxiliares em diversos tipos de estudos genéticos. Diferentes classes de marcadores têm sido desenvolvidas, dentre as quais se destacam os microssatélites. Os microssatélites (SSR) são seqüências simples repetidas de DNA, que se repetem em tandem ao longo do genoma, formando sítios altamente polimórficos, o que possibilita o seu uso como marcas moleculares. Como marcadores, são codominantes, multialélicos, e aplicáveis em diversos tipos de estudos, principalmente no mapeamento genético. Primers que flanqueiam sequências SSR geralmente são desenhados a partir da construção de bibliotecas genômicas, bibliotecas genômicas enriquecidas, sequências depositadas em bancos de dados e, alternativamente, a partir de seqüências internas simples repetidas (ISSR). Geneticistas moleculares têm desenvolvido marcadores SSR com o intuito de mapear genes que codificam determinadas características de interesse. Entretanto, não existe um mapa consenso saturado para o feijão que sirva como referência para auxiliar na construção de mapas específicos. Nesta perspectiva, o Programa de Melhoramento Genético do Feijoeiro do BIOAGRO/UFV desenvolveu uma população de RIL s que poderá ser usada para integrar, em um único mapa, todos os marcadores SSR já desenvolvidos. No entanto, para a saturação do mapa, há necessidade de um grande número de marcadores. O presente trabalho teve o objetivo de desenvolver e validar primers que amplifiquem regiões contendo microssatélites a partir da metodologia da construção de bibliotecas genômicas enriquecidas e a partir de ISSR. Na primeira metodologia, em trabalho anterior, foram construídas duas bibliotecas genômicas enriquecidas para seqüências SSR. No presente trabalho, a partir das bibliotecas genômicas desenvolvidas, foram selecionados 207 clones contendo insertos de tamanho desejado. Destes, foram seqüenciados 196 (94,68%), dos quais 184 (88,89%) puderam ser analisados, sendo 133 clones da biblioteca 1 e 51 da biblioteca 2. Foram detectados 48 (26,09%) clones redundantes. A análise dos clones permitiu identificar 66 (49,62%) motivos SSR na biblioteca 1 e 20 (39,22%) na biblioteca 2, a partir dos quais foram desenhados 56 pares de primers. Destes, 34 tiveram suas condições de amplificação otimizadas e padronizadas e foram testados quanto ao polismorfismo detectado entre 20 genótipos andinos e mesoamericanos, incluindo os genitores AND277 e Rudá. Todos os primers geraram produtos de amplificação e seis (17,65%) amplificaram produtos polimórficos entre os genótipos testados. Em relação à metodologia de enriquecimento por ISSR-PCR foram selecionados 250 clones contendo insertos com tamanho desejado, obtidos a partir da amplificação por ISSRPCR, clonagem dos fragmentos e transformação de células competentes. Dos 250 clones, 168 (67,2%) foram sequenciados e 103 (41,2%) puderam ser analisados. Foram detectados 30 clones redundantes (29,13%). A análise das sequências permitiu identificar 58 motivos microssatélites (56,31%) e foi possível o desenho de 32 pares de primers. Destes, 10 tiveram suas condições de amplificação padronizadas e foram analisados quanto ao polimorfismo detectado entre os mesmos 20 genótipos andinos e mesoamericanos utilizados na metodologia de bibliotecas genômicas enriquecidas. Dos 10 pares de primers testados, seis comportaram-se como marcadores codominantes e quatro como dominantes. Dos codominantes nenhum mostrou-se polimórfico dentre os genótipos testados. Adicionalmente, as sequências contendo motivos microssatélites, obtidas a partir das duas metodologias utilizadas, foram submetidas à busca por similaridade com sequências já caracterizadas em bancos públicos de sequências. Foi identificada similaridade com regiões transcritas e não traduzidas, e com regiões codificadoras de proteínas, a partir do genoma nuclear, mitocondrial e do cloroplasto, e também a partir de sequências advindas de retrotransposons. As duas metodologias utilizadas foram eficazes para a seleção, no feijoeiro, de seqüências contendo microssatélites. Estes resultados representam um primeiro esforço no sentido de selecionar marcadores moleculares que serão futuramente mapeados na população consenso de RILs, além de fornecer marcadores que poderão ser usados nos mais variados tipos de estudos genéticos, contribuindo de fundamental maneira para o aprimoramento dos programas de melhoramento do feijoeiro comum que utilizam marcadores moleculares.

Common bean (Phaseolus vulgaris L.) is a crop of great nutritional, economical and social importance. Breeding programs use molecular markers as important auxiliary tools for various types of genetic studies. Different classes of molecular markers have been developed, and among them microsatellites highlight. Microsatellites are DNA simple sequence repeats (SSR) distributed in tandem along the genome, forming highly variable polymorphic sites, enabling their use as molecular markers. SSRs are codominant, multiallelic, and thus can be used in several types of studies, mainly for genetic mapping. Primers flanking microsatellite sequences are commonly developed from genomic libraries, enriched genomic libraries, sequences obtained from databases and, alternatively, from internal simple sequence repeats (ISSR-PCR). Common bean breeding molecular geneticists have developed SSR markers for mapping specific traits of interest. However, a saturated consensus genetic map for common bean has not been established so far that can be used as a reference for the development of specific maps. Therefore, the BIOAGRO/UFV common bean breeding program developed a population of recombinant inbred lines (RILs) which is suggested to be used to integrate, in one single map, all microsatellite markers that have been developed so far. However, to saturate the map, there must be a great number of markers available. The objective of the present study was to develop and validate primers that amplify microsatellites sequences obtained from enriched genomic libraries and from ISSR sequences. In the first case, two enrichedgenomic libraries for microsatellite sequences, that had been developed in a previous study, were used. In the present study, 207 clones were selected from these two genomic libraries. One hundred and ninety six of these clones (94.68%) were sequenced and 184 (88.89%) of them could be analyzed, 133 clones from library 1 and 51 from library 2. Forty eight redundant clones (26.09%) were detected. Clone analysis led to the identification of 66 (49.62%) microsatellite motifs in library 1 and 20 (39.22%) in library 2, and 56 primer pairs were designed. From the 56 primer pairs developed, 34 were characterized andtested in 20 Mesoamerican and Andean genotypes, including AND277 and Rudá. All the primer pairs were able to generate PCR products and six (17.65%) generated polymorphic DNA bands among the tested genotypes. In the ISSR enrichment methodology, 250 clones were seleted with sizes over 400 bp. From these 250 clones, 168 (67.2%) were sequenced and 103 (41.2%) could be analyzed. Thirty redundant clones (29.13%) were detected. Clone analyses led to the identification of 58 microsatellite motifs (56.31%) and 32 primer pairs were developed. Out of these, 10 were characterized and tested in the same genotypes used in the previous methodology. Out of the 10 primer pairs tested, six were identified as codominant markers and the other four as dominant. The codominant markers revealed no polymorphisms among the tested genotypes. Additionally, microsatellite containing sequences obtained from both methodologies were submitted to BLAST analysis against sequences deposited in public databases. Similarity was identified between the SSR sequences and transcribed and non-transcribed regions, from nuclear, mitochondrial and chloroplast genomes, and also with retrotransposon sequences. Both methodologies were effective for selecting, in common bean, sequences that contain microsatellites. The results obtained represent an initial effort to select molecular markers that will be mapped in the future RIL's consensus population, contributing for the construction of a satured genetic map for the species. In addition, these primers can be used in different types of genetic studies which are important for common bean breeding programs that use molecular markers.