Obtenção de células de Salmonella resistentes a desidratação para o preparo de material de referência

Abstract

Programas de controle e gestão da qualidade em laboratórios, a necessidade de padronização dos métodos de análise e repetibilidade dos dados experimentais têm impulsionado o aumento da utilização de Material de Referência (MR) nas análises microbiológicas. Considerando que as etapas de preparo e armazenamento do MR são processos estressantes que ocasionam injúrias ao micro-organismo teste faz-se necessário a preparação das células para tolerar a variação de temperatura e umidade a que são submetidas durante a liofilização e o armazenamento. Objetivouse, neste trabalho, obter células de Salmonella enterica resistentes a liofilização para o preparo de MR e avaliar a estabilidade destas células ao longo da estocagem. O crescimento de Salmonella enterica sorotipo Enteritidis PT4 578 foi acompanhado em caldo infusão cérebro coração (BHI) e meio mínimo de sais (MMS) acrescido dos solutos 0,5 M de cloreto de sódio (NaCl), 3 mM de trealose e, ou 0,05 mM de glicose. A sobrevivência após a liofilização foi determinada pela contagem do número de unidades formadoras de colônias (UFC.g-1). Avaliou-se o efeito do choque térmico nas células de Salmonella Enteritidis PT4 578 a 50 °C por 30 min no aumento da resistência à liofilização. Foi também avaliada a influência dos substratos de desidratação na resistência de células de Salmonella Enteritidis PT4 578 e a estabilidade do MR preparado durante 90 dias de estocagem a -20 °C e 4 °C. O meio de cultivo que garantiu a maior sobrevivência das células de Salmonella Enteritidis PT4 578 à liofilização foi o MMS, adicionado de NaCl, trealose e sacarose indicando que o estresse nutricional confere resistência cruzada à liofilização. O choque térmico diminui a viabilidade celular, após a liofilização. A adição de 100 mM de trealose e, ou sacarose ao leite desnatado reconstituído (LDR 10 %) como substrato de desidratação, aumentou a estabilidade das células de Salmonella Enteritidis PT4 578 no MR estocado a 4 °C e - 20 °C. A temperatura de estocagem de 4 °C resultou em perda da viabilidade celular em cerca de 2 ciclos logarítmicos após 90 dias de estocagem enquanto a -20 °C não houve perda na viabilidade celular significativa. Os resultados indicam que, para a obtenção de MR com maior estabilidade, há a necessidade do preparo da células de Salmonella Enteritidis PT4 578 para apresentar maior resistência a liofilização, submetendo estas células a condições de estresses nutricional e osmótico durante o cultivo e a inclusão de osmoprotetores (trealose ou sacarose) no substrato de desidratação.

Programs of control and management of the quality in laboratories, the necessity of standardization of the analysis methods and repeatability of the experimental data have stimulated the increase of the use of Reference Material (RM) in the microbiological analyses. Considering that the stages of preparation and storage of the MR are stress processes that causes to injuries to the microorganism test the preparation of the cells becomes necessary to tolerate the variation of temperature and humidity the one that is submitted during the frezze- drying and storage. It was objectified, in this work, to get resistant cells of Salmonella enterica the frezze-drying for the RM preparation and to evaluate the stability of these cells throughout the stockage. The growth of enteric Salmonella sorotipo Enteritidis PT4 578 was folloied in broth brain heart infusion (BHI) and mineral salts medium (MMS) increased of 0,5 M sodium chloride (NaCl), 3 mM of trehalose e, or 0,05 mM of glucose. The survival after the frezze-drying was determined by the counting of the number of form units of colonies (UFC.g-1). The effect of the thermal shock in the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 was evaluated the 50 °C in the increase of the resistance to the frezze- drying. Also the influence of substrata of dehydration in the resistance of cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 and the stability of the RM was evaluated during 90 days of stockage in the 4 °C the - 20 °C. The way of culture that guaranteed the biggest survival of the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 to the frezze-drying was the MMS, added of the evaluated solutos indicating it nutricional stress confers resistance crossed to the frezze-drying. The thermal shock diminishes the cellular viability, after the frezze-drying. The addition of 100 mM of trealose e, or sacarose to skimmed milk reconstituted (LDR) the 10%, increased the stability of the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 in the storaged MR the 4 °C and - 20 °C. The temperature of stockage of 4 °C resulted in loss of the cellular viability in about 2 logarithmic cycles after 90 days stockage while the -20 °C the loss in the cellular viability was ten times lesser. The results detach that, for the attainment of MR with bigger stability, it has the necessity of the preparation of the cells of Salmonella Enteritidis PT4 578 to present greater resistance the frezze-drying, considering conditions of nutricional stress and osmotic during the culture and the inclusion of osmoprotectant in the dehydration substratum.