Obtenção de linhagens de Kluyveromyces lactis recombinantes produtoras de estreptavidina

Abstract

A forte interação da proteína estreptavidina pela molécula de biotina constitui um excelente sistema para a separação e/ou imobilização de proteínas e de enzimas de interesse industrial. Com a intenção de produzir proteínas com propriedades de adsorção biosseletiva, nós temos modificado a seqüência do plasmídeo pKLAC1 pela inserção do domínio de afinidade da estreptavidina pela biotina. Utilizando a técnica da Reação da Polimerase em cadeia (PCR), a seqüência de cerca de 355pb foi amplificada a partir do vetor pSTP4 que contém toda seqüência de nucleotídeos referente à proteína estreptavidina. O Fragmento amplificado apresentou 100% de identidade com a seqüência de nucleotídeos da proteína estreptavidina depositada no Gene Bank. O fragmento foi inserido no vetor pKLAC1 nos sítios Xho I e Bgl II em fase com a seqüência do peptídeo sinal do mating-α-factor. O plasmídeo pKLAC1/cStp foi linearizado com enzima Ahd I e foi utilizado para a transformação das linhagens de K. lactis MW 98.8C e CBS 2359. Os transformantes selecionados em meio YCB (Yeast Carbon Base) contendo 5 mM de acetamida como única fonte de nitrogênio e confirmados por PCR foram mitoticamente estáveis. A alta biomassa celular (DO600 = 18) obtida em erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio YPD foi centrifugada e transferida para meio de indução contendo 2% (p/v) de lactose. O sobrenadante das culturas foi analisado qualitativamente para estreptavidina pela técnica de SDS PAGE. As proteínas totais foram determinadas pelo método de BRADFORD utilizando BSA (Albumina Bovina Sérica) como padrão. As amostras foram coletadas a cada 24 horas durante 6 horas de cultivo sob regime de batelada. A atividade da proteína estreptavidina presente no sobrenadante das culturas recombinantes foi determinada pelo teste do reagente HABA. Os meios YPL e YNB contendo 0,5% de extrato de levedura exibiram os melhores resultados quanto à produção extracelular de estreptavidina ativa e de proteínas totais.

The high affinity interaction streptavidin-biotin provides an excellent system for industrial enzyme separation or immobilization involving a fused streptavidin-enzyme and a biotinylated support. In order to produce proteins with affinity to biotin, we have modified the commercial K. lactis system, pKLAC1 (New England Biolabs), a LAC4 promoter-driven integration vector for protein expression, with the gene coding streptavidin. The codifying sequence for biotin binding domain of streptavidin (cStp) was amplified by PCR from pSTP4, purified and subcloned to the pCR2.1TOPO (Invitrogen). The fragment has revealed 100% identity with streptavidin gene according to Gene Bank and it was inserted into Xho I / Bgl II pKLAC1 in frame with mating-α-factor signal peptide. The pKLAC1/cStp cut by Ahd I enzyme was used to transform the strains K. lactis MW 98.8C and CB S2359. The transformants selected in Yeast Carbon Base (YCB) containing 5 mM acetamide and confirmed by PCR were mitotically stable. A high cell biomass (OD 600 = 18), obtained in shake-flask 50 mL YPD medium, was centrifuged and transferred to an induction medium, containing 2% of lactose. The cell free medium was qualitatively analyzed for streptavidin and proteins by SDS PAGE. The samples were collected in each 24 hours during 6 days of bath culture. The biotin binding activity of streptavidin in the culture supernatant was determined by HABA test. The medium YPL and YNB with 0,5% of yeast extract have exhibited the best yields for streptavidin extracellular protein production.