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Tipo: Dissertação
Título: Caracterização molecular e biológica do begomovírus Soybean chlorotic spot virus e construção de um vetor de silenciamento baseado na modificação de seu genoma
Biological and molecular characterization of the begomovirus Soybean chlorotic spot virus and construction of a silencing vector based on the modification of its genome
Autor(es): Côco, Daniela
Abstract: O gênero Begomovirus (família Geminiviridae) inclui vírus com genoma composto por uma ou duas moléculas de DNA fita simples, transmitidos a espécies de plantas dicotiledôneas pela mosca-branca Bemisia tabaci. No Brasil, os begomovírus são um dos principais entraves para a produtividade do feijoeiro e tomateiro. Entretanto, begomovírus infectando soja (Glycine max) tem sido apenas esporadicamente relatados. Neste trabalho, foi isolado uma espécie do gênero Begomovirus infectando soja na região de Jaiba-MG e designado Soybean chlorotic spot virus (SoCSV). Para a caracterização da espécie, foi feita a clonagem de seu genoma completo seguida de análise molecular, e da obtenção de clones infecciosos para a determinação de sua gama de hospedeiros. Extratos de DNA total de plantas infectadas foram utilizados para a amplificação do genoma viral completo utilizando-se a DNA polimerase do fago ф29. Os produtos da amplificação foram clonados em plasmídeos, completamente sequenciados e submetidas a análise filogenética. O DNA-A de SoCSV apresentou maior identidade de sequência com o vírus Macroptilium yellow spot virus (85% de identidade), enquanto o DNA-B apresentou maior identidade com o Bean golden mosaic virus (67% de identidade). Este nível de conservação de sequências de SoCSV é suficientemente dissimilar (menos que 89%) para ser considerado uma nova espécie de begomovírus. Nos testes de gama de hospedeiros, dentre as espécies testadas foi constatada a infecção viral nas espécies Nicotiana clevelandii, N. tabacum e N. glutinosa, entretanto nenhum sintoma macroscópico foi observado. As plantas das espécies Capsicum annuum, N. benthamiana, N. debneyi, N. rustica e Glycine max, apresentaram sintomas leves. Os sintomas mais severos foram observados nas espécies Phaseolus vulgaris ‘Pérola’ e ‘Ouro Negro’, consistindo em deformação foliar, bolhosidade, clorose entre as nervuras, mosaico e mosaico dourado. Com o objetivo de induzir o silenciamento de genes em plantas de soja, foi construído um vetor de silenciamento viral baseado no DNA-A do SoCSV, denominado pUFV1713, através da substituição da maior parte da sequência que codifica a proteína capsidial (CP) por um sítio múltiplo de clonagem. Assim como os outros begomovírus, o SoCSV demonstrou não necessitar da proteína capsidial para causar infecção sistêmica. A construção do vetor viral foi confirmada por PCR, clivagem enzimática e sequenciamento. A capacidade de pUFV1713 induzir o silenciamento gênico foi testada com a inserção de um fragmento do gene magnesium chelatase subunit I (ChlI) no seu sítio múltiplo de clonagem, seguido por inoculação em plantas de soja. A infecção viral foi confirmada via PCR aos 21 dias pós-inoculação (dpi). O decaimento dos transcritos do gene endógeno ChlI foi avaliado por PCR em tempo real. Os dados do qRT-PCR confirmam a diminuição dos níveis de expressão do mRNA do gene ChlI nas plantas infectadas mas não nas plantas controles. Coletivamente, estes resultados indicam que o vetor VIGS derivado de SoCSV tem o potencial para aplicações em análises de genômica funcional de soja.
The genus Begomovirus (family Geminiviridae) includes viruses with mono or bipartite ssDNA genomes that are transmitted to dicotyledonous plant species by the whitefly Bemisia tabaci. In Brazil, begomoviruses are considered major constraints to tomato and bean production. However, soybean (Glycine max) infecting begomoviruses have been only sporadically reported. In this investigation, a new begomovirus species was isolated from a soybean plant in Jaiba-MG and designated Soybean chlorotic spot virus (SoCSV). The DNA-A and DNA-B of this new virus species were cloned, sequenced and infectious clones were obtained to determine the host range. Total DNA extracts from infected plants were used for the amplification of the full-length viral genome through phage ф29 DNA polymerase. The amplified fragments were cloned into plasmids, sequenced and submitted to phylogenetic analysis. The DNA-A of SoCSV was more closely related to Macroptilium yellow spot virus Tomato (85% identity), whereas the DNA-B was more closely related to Bean golden mosaic virus (67% identity). This level of sequence conservation of SoCSV is sufficiently dissimilar (less than 89%) to be considered a new species of Begomovirus. For the host range experiments, among the analyzed species, SoCSV was capable to cause a symptomless infection in Nicotiana clevelandii, N. tabacum e N. glutinosa. The plant species Capsicum annuum, N. benthamiana, N. debneyi, N. rustica and Glycine max displayed mild symptoms. The most severe symptoms were developed in the species Phaseolus vulgaris ‘Pérola’, and ‘Ouro Negro’, which consisted on leaf distortion, blistering, interveinal chlorosis, mosaic and golden mosaic. To induce gene silencing in soybean plants, we developed a SoCSV DNA-A-based silencing vector, designated pUFV1713, by replacing the majority of the coat protein (CP) sequences with a multiple cloning site. Like other begomoviruses, SoCSV did not require the coat protein for infection. The construction of the viral vector was confirmed by PCR, restriction analysis and sequencing. The capacity of pUFV1713 of inducing gene silencing was tested by cloning a magnesium chelatase subunit I (ChlI) gene fragment in its multiple cloning site followed by inoculation in soybean plants. Vairal infection was confirmed via PCR at 21 days post-inoculation (dpi). The decay of ChlI transcripts was monitored by real time RT-PCR. The results of qRT-PCR confirmed the decrease in the levels of ChlI mRNA expression in the infected plants but not in the control plants. Collectively, these results indicate that the SoCSV-derived VIGS vector has a potential for application in soybean functional genomics analysis.
Palavras-chave: Soja
Vírus
CNPq: Bioquímica
Editor: Universidade Federal de Viçosa
Citação: CÔCO, Daniela. Caracterização molecular e biológica do begomovírus Soybean chlorotic spot virus e construção de um vetor de silenciamento baseado na modificação de seu genoma. 2012. 83 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2012.
Tipo de Acesso: Acesso Aberto
URI: http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/6525
Data do documento: 24-Fev-2012
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