Locus  

Construção de uma linhagem recombinante de Kluyveromyces marxianus UFV-3 para expressão da proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1

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dc.contributor Silveira, Wendel Batista da
dc.contributor Paula, Sérgio Oliveira de
dc.contributor.advisor Passos, Flávia Maria Lopes
dc.creator Bragança, Caio Roberto Soares
dc.date.accessioned 2015-11-06T14:41:38Z
dc.date.available 2015-11-06T14:41:38Z
dc.date.issued 2013-03-15
dc.identifier.citation BRAGANÇA, Caio Roberto Soares. Construção de uma linhagem recombinante de Kluyveromyces marxianus UFV-3 para expressão da proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1. 2013. 29f. Dissertação (Mestrado em Microbiologia Agrícola) - Universidade Federal de Viçosa, Viçosa. 2013. pt-BR
dc.identifier.uri http://www.locus.ufv.br/handle/123456789/6565
dc.description.abstract A levedura Kluyveromyces marxianus tem sido considerada uma candidata hospedeira para a síntese industrial de biomoléculas. Apesar de seu potencial, são poucos os estudos que relatam a expressão de proteínas heterólogas utilizando esta levedura. Neste trabalho, foi relatado pela primeira vez, a expressão da proteína do vírus da dengue em K. marxianus. O gene que codifica a proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1 foi integrado no genoma da levedura K. marxianus UFV-3 no locus LAC4, utilizando um vetor integrativo adaptado projetado para expressão de proteínas recombinantes em Kluyveromyces lactis. O gene de dengue-1 NS1 foi otimizado utilizando os códons preferenciais para aumentar os níveis de expressão de proteínas em leveduras. O gene sintético foi clonado “in frame” com o peptídeo sinal (mating-α-factor) de K. lactis e o plasmídeo recombinante obtido foi utilizado para transformar K. marxianus UFV-3 por eletroporação. As células transformantes selecionadas em YPD (yeast extract peptone dextrose) contendo 200 ug mL-1 de geneticina foram mitoticamente estáveis. A análise das linhagens recombinantes por meio de RT-PCR e a detecção da proteína utilizando Dot-blot confirmou a transcrição e a expressão dos peptídeos extracelulares. Após a indução com galactose, a proteína NS1 foi analisada por SDS-PAGE e Western blot. A produção da proteína foi investigada sob duas condições: com pulso de galactose e biotina com intervalos de 24 horas durante 96 horas após a indução e sem pulso de galactose e biotina. A atividade proteolítica não foi detectada no sobrenadante das culturas. Nossos resultados indicam que células recombinantes de K. marxianus podem ser consideradas boas hospedeiras para a produção de proteínas do vírus de dengue, que têm um potencial para aplicações em diagnósticos. pt-BR
dc.description.abstract The yeast Kluyveromyces marxianus has been considered a candidate host for industrial synthesis of biomolecules. Despite its potential, there are few studies reporting the expression of heterologous proteins using this yeast. Here, it was reported for the first time a dengue viral protein expression in K. marxianus. The dengue virus type 1 nonstructural protein 1 (NS1) was integrated into the K. marxianus UFV-3 genome at the LAC4 locus using adapted integrative vector designed for high-level expression of recombinant protein in Kluyveromyces lactis. The gene of dengue-1 NS1 was optimized using preferential codons to increase the levels of proteins expression in yeast. The synthetic gene was cloned in frame with K. lactis mating-α-factor signal peptide and the recombinant plasmid obtained was used to transform K. marxianus UFV-3 by electroporation. The transformants cells selected in Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) containing 200 μg mL-1 Geneticin were mitotically stable. The analysis of recombinant strains by RT-PCR technique and the protein detection using blot analysis have confirmed both transcription and expression of the extracellular peptides. After induction with galactose, the NS1 protein was analyzed by SDS-PAGE and immunogenic detection. The protein production was investigated under two conditions: with galactose and biotin pulse at 24 hours intervals during 96 hours of induction and without galactose and biotin pulse. Protease activity was not detected into the medium. Our results indicate that the constructed recombinant K. marxianus can be considered good host for the production of dengue virus proteins, which have a potential for diagnostic applications. en
dc.description.sponsorship Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior pt-BR
dc.language.iso por pt-BR
dc.publisher Universidade Federal de Viçosa pt-BR
dc.rights Acesso Aberto pt-BR
dc.subject Kluyveromyces marxianus pt-BR
dc.subject Leveduras (Fungos) pt-BR
dc.subject Reação em cadeia de polimerase pt-BR
dc.subject Proteínas recombinantes pt-BR
dc.subject Peptídeos pt-BR
dc.subject Dengue pt-BR
dc.title Construção de uma linhagem recombinante de Kluyveromyces marxianus UFV-3 para expressão da proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1 pt-BR
dc.title Construction of recombinant Kluyveromyces marxianus UFV-3 to express dengue virus type 1 nonstructural protein 1 (NS1) en
dc.type Dissertação pt-BR
dc.subject.cnpq Microbiologia Agrícola pt-BR
dc.creator.lattes http://lattes.cnpq.br/4727682406077541 pt-BR
dc.degree.grantor Universidade Federal de Viçosa pt-BR
dc.degree.department Departamento de Microbiologia pt-BR
dc.degree.program Mestre em Microbiologia Agrícola pt-BR
dc.degree.local Viçosa - MG pt-BR
dc.degree.date 2013-03-15
dc.degree.level Mestrado pt-BR


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  • Microbiologia Agrícola [303]
    Teses e dissertações defendidas no Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola

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